单细胞图谱构建与细胞亚群鉴定
构建肺组织免疫细胞的单细胞转录组图谱，识别29种转录不同的免疫细胞亚群。
从120例肺癌手术患者非肿瘤肺组织中分离CD45+免疫细胞，通过FACS分选5种主要免疫细胞群体，进行scRNA-seq，经无监督聚类鉴定29种免疫细胞亚群。
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组织驻留免疫细胞驱动自身免疫性疾病和肺部疾病的遗传风险
Tissue-resident immune cells drive genetic risk in autoimmune and lung diseases
实验完整度
高研究包含单细胞RNA-seq、单细胞ATAC-seq、WGS、eQTL分析、共定位分析、遗传力分析以及ZFP57敲低功能实验等多个独立证据层级，并包含功能验证。
主要模型
29种肺组织驻留免疫细胞亚群（来自120例个体的scRNA-seq） 5种主要肺免疫细胞类群（CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞、B细胞、髓系细胞）的scATAC-seq 单核细胞来源的巨噬细胞（MDMs）体外培养模型
重点核对
eQTL分析中使用的29种免疫细胞亚群及其样本量（120例个体） eQTL分析的协变量（性别、年龄、PEER因子、基因型PC） eQTL显著性阈值（raw P < 0.0001，Padj FDR < 0.05） 共定位分析的条件（p12 = 1e-5，PP4 > 0.5，PP4/PP3 >= 5） ZFP57敲低实验的ASO浓度（2.0 µM）和LPS刺激条件（0.8 µg/ml，6小时）
摘要
常见遗传变异与肺部和自身免疫性疾病的风险相关。然而，我们对这些疾病变异的病理效应，特别是在肺部感染和疾病前沿的组织驻留免疫细胞中的效应，了解有限。为解决这一问题，我们对从肺组织中分离的29个不同免疫细胞亚群进行了单细胞表达数量性状位点（eQTL）分析。肺免疫细胞eQTL与肺部疾病、感染性疾病和自身免疫性疾病的基因组广泛关联研究（GWAS）信号的共定位分析，揭示了疾病相关变异及其靶基因在单一或受限细胞类型组中发挥作用。包括ZFP57在内的几个基因，在肺免疫细胞eQTL与多种系统性及器官限制性自身免疫性疾病的GWAS信号之间显示出显著的共定位，突出了疾病风险背后的共享遗传机制。总体而言，我们的研究表明，多种自身免疫性疾病的相关变异影响组织驻留免疫细胞类型中的基因表达（https://lung.dice-database.org）。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 常见遗传变异是否及如何通过影响组织驻留免疫细胞的基因表达来驱动自身免疫性和肺部疾病的遗传风险？
- 核心机制
- 疾病相关变异通过影响特定肺组织驻留免疫细胞亚群中的基因表达（eQTL）来介导疾病风险，部分变异通过破坏或增强转录因子结合基序（如ZNF219、YY1、EGR1、OVOL2）来调控基因表达。
- 主要证据
- 对120例个体的29种肺免疫细胞亚群进行单细胞eQTL分析，共定位分析发现492个与疾病相关的eGenes，并鉴定出如ZFP57、IFITM3、IRF5等候选基因；ZFP57敲低实验显示其调控MDMs中细胞因子和趋化因子的表达。
- 研究意义
- 本研究提供了肺组织驻留免疫细胞的eQTL资源，有助于揭示疾病相关基因和细胞类型，并可能用于开发多基因风险评分，为理解自身免疫和肺部疾病的遗传机制提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
性别偏倚基因表达分析
探索生物学性别对肺组织驻留免疫细胞基因表达的影响。
比较男性和女性个体中29种免疫细胞亚群的基因表达差异，鉴定性别偏倚转录本。
eQTL分析
鉴定肺组织驻留免疫细胞中基因表达的遗传调控位点（eQTL）。
对29种免疫细胞亚群分别进行cis-eQTL分析，将基因表达与6,879,375个常见变异（MAF≥0.05）关联，并应用SuSiE进行精细映射。
性别偏倚eQTL分析
鉴定eQTL效应在性别间的差异。
分别在女性和男性个体中重复eQTL分析，比较eQTL效应大小。
染色质可及性分析
检查疾病风险变异在肺免疫细胞开放染色质区域的富集情况。
对5种主要肺免疫细胞群体进行scATAC-seq，使用GARFIELD评估疾病风险变异在ATAC-seq峰中的富集。
共定位分析
鉴定与疾病GWAS信号共定位的肺免疫细胞eQTL，以推断致病基因和细胞类型。
将肺免疫细胞eQTL与多个疾病的GWAS数据进行COLOC共定位分析，确定可能的因果变异。
遗传力分析
估计基因表达介导的疾病遗传力比例，评估肺免疫细胞的贡献。
使用MESC和cTWAS方法分析肺免疫细胞eQTL对疾病遗传力的贡献。
ZFP57功能验证
验证ZFP57在巨噬细胞中的功能作用。
在单核细胞来源的巨噬细胞（MDMs）中敲低ZFP57，检测LPS刺激后的基因表达变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织解离 | Liberase DL | Roche | -- |
| DNase I | Sigma-Aldrich | -- | |
| RPMI-1640培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞分离 | FcR阻断试剂 | Miltenyi Biotec | -- |
| Hashtag TotalSeq-C抗体 | -- | -- | |
| 细胞分选 | FACSAria Fusion细胞分选仪 | Becton Dickinson | -- |
| scRNA-seq | 10x Genomics 5' Tag v2.0试剂盒 | 10x Genomics | -- |
| RNA酶抑制剂 | Takara Bio | -- | |
| 超纯牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | -- | |
| scATAC-seq | 10x Genomics Chromium Next GEM单细胞ATAC试剂盒v1.1 | 10x Genomics | -- |
| WGS | DNeasy血液和组织试剂盒 | QIAGEN | -- |
| Covaris E220聚焦超声仪 | Covaris | -- | |
| NEBNext Ultra II DNA文库制备试剂盒（Illumina） | NEB | E7645L | |
| NEBNext多重寡核苷酸（Illumina） | NEB | E7600S | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter Life Science | -- | |
| PicoGreen双链DNA定量试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 5200片段分析仪自动CE系统 | Agilent Advanced Analytical | -- | |
| 测序 | Illumina NovaSeq 6000 | Illumina | -- |
| ZFP57敲低 | AUMsilence ZFP57反义寡核苷酸 | AUM BioTech | -- |
| AUMscramble反义寡核苷酸 | AUM BioTech | -- | |
| 经典单核细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | -- | -- | |
| miRNeasy Micro试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| SuperScript III第一链合成系统 | Life Technologies | -- | |
| Fast Start Universal SYBR Green预混液 | Roche | -- | |
| QuantStudio 6 Flex实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| TRIzol试剂 | Invitrogen | -- | |
| 脂多糖 | -- | -- | |
| 测序 | Illumina NovaSeq X | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集和处理 | 肺癌患者非肿瘤肺组织来源（距离肿瘤至少5cm），立即处理并冷冻保存，酶解方案（Liberase DL 0.15WU/ml，DNase I 800U/ml，37°C，15分钟） 阅读提示：Methods中'Study and details of individuals included in this cohort'和'Sample processing' |
| 细胞分选 | FACS分选策略（表面标志物），5种主要免疫细胞群（CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞、B细胞、髓系细胞），每个个体分选的细胞数 阅读提示：Extended Data Fig. 1和Supplementary Table 13 |
| scRNA-seq文库制备 | 每个文库约50,000个细胞（来自10个个体），10x Genomics 5' Tag v2.0试剂盒，扩增循环数（cDNA 13 cycles，基因表达文库13 cycles，hashtag文库7 cycles） 阅读提示：Methods中'Cell isolation and preparation of scRNA-seq libraries' |
| eQTL分析 | Pseudo-bulk表达（每个个体至少10个细胞），协变量（基因型PC1、2个PEER因子、性别、年龄），表达过滤（>1%细胞或>5%个体），显著性阈值（raw P<1e-4，Padj FDR<0.05） 阅读提示：Methods中'Mapping of DICE eQTLs and statistical analyses' |
| scATAC-seq分析 | TSS富集分数阈值（CD4+和CD8+ T细胞≥10，其他≥8），unique fragments≥3162，双细胞去除，峰值调用（MACS2） 阅读提示：Methods中'Analysis of scATAC–seq data' |
| 共定位分析 | p12 = 1e-5，COLOC框架，LD独立单倍型块，PP4>0.5，PP4/PP3≥5 阅读提示：Methods中'Complex trait associations of DICE cis-eQTLs utilizing colocalization analysis' |
| ZFP57敲低实验 | ASO浓度（2.0 µM），M-CSF（100 ng/ml）处理10天，LPS刺激（0.8 µg/ml，6小时），RNA-seq分析标准（baseMean>100，Padj<0.05，log2FC>0.5） 阅读提示：Methods中'Validation of gene function in immune cells' |