检测CCR1在hVSMCs中的表达和受体相互作用
确认CCR1在hVSMCs中表达，并检测CCR1与α1B-AR和AVPR1A之间的相互作用。
通过RT-PCR检测CCR1 mRNA，并通过PLA检测单个受体和受体对（CCR1-α1B-AR，CCR1-AVPR1A）的相互作用。
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趋化因子（C-C基序）受体1的激活调节α1B-肾上腺素能受体和精氨酸加压素受体1A的信号传导及功能
Activation of Chemokine (C-C Motif) Receptor 1 Modulates α1B-Adrenoceptor and Arginine Vasopressin Receptor 1A Signaling and Function
实验完整度
高包含重组细胞中的BRET和β-抑制蛋白招募、TRUPATH Gαq激活实验，以及原代hVSMCs中的PLA、siRNA敲低、IP3测量和胶原凝胶收缩实验，涵盖体外重组和原代细胞两个证据层级，并进行功能验证。
主要模型
HEK293T细胞（重组受体共表达） 原代人血管平滑肌细胞（hVSMCs）
重点核对
HEK293T细胞转染受体组合（α1b-AR、AVPR1A、CCR1）及BRET供体/受体标签 hVSMCs中siRNA敲低CCR1（1 μM，Accell Delivery Media） IP3测量中激动剂浓度（PE 1 μM，aVP 1 μM，CCL23 50 nM）和刺激时间（5分钟） 胶原凝胶收缩实验中激动剂浓度（PE 2.5 μM，aVP 0.5 μM，CCL23 10-1000 nM）和收缩时间（30分钟）
摘要
背景：我们之前报道过α1B-AR（α1B-肾上腺素能受体）和AVPR1A（精氨酸加压素受体1A）在人单核细胞中与CCR1（C-C基序[趋化因子]受体1）异源二聚化，通过该过程CCR1受到调控。CCR1是否影响α1B-AR和AVPR1A的信号传导，以及这种复合物在人体血管平滑肌细胞（hVSMCs）中是否可检测到，目前尚不清楚。方法与结果：生物发光共振能量转移提示这些受体可以形成异源寡聚复合物。在用CCL23（趋化因子[C-C基序]配体23）激活CCR1后，增加了精氨酸加压素（aVP）刺激的AVPR1A的效能，并降低了苯肾上腺素刺激的α1b-AR激活G蛋白α亚基（Gαq）的效能，这是在共表达所有三种受体的细胞中观察到的。尽管在共表达CCR1时，CCL23增加了aVP和苯肾上腺素分别招募β-抑制蛋白到AVPR1A和α1b-AR的效能，但当所有三种受体都存在时，CCL23不影响激动剂刺激的AVPR1A和α1b-AR的β-抑制蛋白招募。邻近连接实验提示这种受体复合物在hVSMCs中表达。在每种受体的小干扰RNA敲低后进行邻近连接实验表明，CCR1与AVPR1A之间的相互作用依赖于α1B-AR的存在，而CCR1与α1B-AR之间以及α1B-AR与AVPR1A之间的相互作用不受第三种受体伴侣存在的影响。CCL23增加了aVP刺激的hVSMCs的IP3（三磷酸肌醇）产生和凝胶收缩，同时抑制了苯肾上腺素刺激的hVSMCs的IP3产生和凝胶收缩。结论：我们的发现提示，CCR1在与α1B-AR和AVPR1A形成的功能性异源复合物中，调节了hVSMCs中α1B-AR和AVPR1A激活下游信号级联的效能，这些信号级联介导血管收缩并调节血管张力。关键词：α1B-肾上腺素能受体，精氨酸加压素受体1A，趋化因子（C-C基序）受体1，G蛋白偶联受体异源二聚体，血管平滑肌收缩。学科类别：基础科学研究，炎症，机制，病理生理学，血管生物学。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CCR1是否调节α1B-AR和AVPR1A的信号传导，以及这些受体异源复合物在hVSMCs中是否可检测并具有功能。
- 核心机制
- CCR1与α1B-AR和AVPR1A形成功能性异源三聚体复合物；CCR1激活增强AVPR1A介导的Gαq信号，同时抑制α1B-AR介导的Gαq信号，从而调节下游血管收缩相关信号。
- 主要证据
- 在HEK293T细胞中，CCR1激活（CCL23）增加了aVP刺激的Gαq激活并降低了苯肾上腺素刺激的Gαq激活（仅在所有三种受体共表达时）；在hVSMCs中，CCL23增强aVP诱导的IP3产生和凝胶收缩，而抑制苯肾上腺素诱导的IP3产生和凝胶收缩。
- 研究意义
- 研究首次揭示CCR1在血管平滑肌功能调节中的直接作用，提示CCR1可能参与血管张力控制，并可能与CCL23在心血管疾病中的关联相关。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
重组受体异源寡聚化验证
验证CCR1、α1b-AR和AVPR1A在重组系统中能够形成异源二聚体/三聚体，并评估第三种受体或CCL23的影响。
在HEK293T细胞中共表达受体，使用BRET滴定实验检测BRETmax和BRET50，并用双分子荧光互补BRET检测受体三聚体形成；同时检测CCL23对BRET信号的影响。
hVSMCs中受体复合物依赖性验证
确定每种受体在hVSMCs中对其他受体对相互作用的影响。
用siRNA敲低CCR1、α1B-AR或AVPR1A，然后通过PLA定量各受体对的相互作用。
重组系统中Gαq激活和β-arrestin招募检测
评估CCR1激活（CCL23）对α1b-AR和AVPR1A介导的Gαq激活和β-arrestin招募的影响。
使用TRUPATH BRET生物传感器测量Gαq激活，用BRET测量β-arrestin 2招募；在不同受体组合（单独、双表达、三表达）下，用PE或aVP刺激，并加入CCL23。
hVSMCs中IP3产生和收缩功能验证
验证CCL23（激活CCR1）对hVSMCs中α1B-AR和AVPR1A下游功能（IP3产生和凝胶收缩）的调节作用。
使用siRNA敲低CCR1后，用PE或aVP（±CCL23）刺激hVSMCs，测量IP3水平；在胶原凝胶收缩试验中，用PE或aVP（±CCL23）处理hVSMCs，测量凝胶收缩百分比。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证受体相互作用
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 血管基础培养基 | ATCC (PCS-100-030) | PCS-100-030 | |
| 血管平滑肌生长试剂盒 | ATCC (PCS-100-042) | PCS-100-042 | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 细胞处理 | CCL23 | Protein Foundry | -- |
| 转染 | TransIT-2020转染试剂 | Mirus Bio | -- |
| RNA干扰 | Accell CCR1小干扰RNA | GE Dharmacon | -- |
| 非靶向小干扰RNA | GE Dharmacon | -- | |
| Accell递送培养基 | GE Dharmacon | -- | |
| 蛋白检测 | 兔抗α1B-AR抗体 | Abcam | ab169523 |
| 兔抗AVPR1A抗体 | Bioss | bs-11598R | |
| 小鼠抗AVPR1A抗体 | LSBio | LS-C196728 | |
| 小鼠抗CCR1抗体 | R&D Systems | MAB145 | |
| 小鼠免疫球蛋白G | R&D Systems | -- | |
| 兔免疫球蛋白G | R&D Systems | -- | |
| Alexa 594偶联二抗 | Invitrogen | A11005, | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RT-PCR | 高容量cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | -- |
| 人CCR1引物 | IDT | -- | |
| BRET | 腔肠素H | -- | -- |
| 腔肠素400a | -- | -- | |
| IP3测量 | IP3酶联免疫吸附测定试剂盒 | LS BIO | F10644 |
| 蛋白浓度测定 | DC蛋白测定试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| 凝胶收缩 | 细胞收缩检测试剂盒 | Cell Biolabs | -- |
| 仪器 | Biotek Synergy HT4酶标仪 | Biotek | -- |
| Keyence显微镜（BZ-X710） | Keyence | BZ-X710 | |
| ChemiDoc成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与转染 | HEK293T细胞培养条件（DMEM高糖，10% FBS，100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素，37°C，5% CO2）；hVSMCs培养条件（血管基础培养基+生长因子，37°C，5% CO2）；转染试剂（TransIT-2020）及DNA用量 阅读提示：Methods: Cells and Cell Culture; Plasmids |
| BRET实验 | 转染受体标签（RLuc/YFP）比例；CCL23浓度（50 nM）；Coelenterazine H或400a浓度（5 μM）；孵育时间（10分钟） 阅读提示：Methods: Bioluminescence Resonance Energy Transfer |
| PLA实验 | 抗体稀释度（抗CCR1 1:1000，抗α1B-AR 1:500，抗AVPR1A 1:750）；siRNA敲低条件（1 μM，3天） 阅读提示：Methods: Proximity Ligation Assays; Gene Silencing by RNA Interference |
| IP3测量 | siRNA敲低时间（3天）；激动剂浓度（PE 1 μM，aVP 1 μM，CCL23 50 nM）及刺激时间（5分钟）；ELISA试剂盒（LS BIO，F10644） 阅读提示：Methods: Inositol Trisphosphate Measurements; Figure 9 |
| 凝胶收缩实验 | 细胞代数（P3-P4）；细胞密度（3×10^6 cells/mL）；激动剂浓度（PE 2.5 μM，aVP 0.5 μM，CCL23 10-1000 nM）及处理时间（30分钟） 阅读提示：Methods: Collagen Gel Contraction Assay; Figure 9 |
| 信号检测 | Gαq激活（TRUPATH biosensor）；β-arrestin招募（BRET）；激动剂浓度-效应曲线 阅读提示：Methods: Gαq Activation; β-Arrestin Recruitment Assay |