Defining the lineage of thermogenic perivascular adipose tissue
研究包含单细胞转录组、体外分化、遗传谱系追踪、体内药物处理及人类样本单核RNA-seq等多个独立证据层级，并进行功能与机制验证。
小鼠胸主动脉PVAT 人主动脉PVAT样本 人深颈部棕色脂肪（public dataset）
小鼠品系（C57/Bl6、CD1）及年龄（胚胎、新生、成年） 单细胞RNA测序的细胞分选策略及标记基因（如LY6A、CD142、CD200） 遗传谱系追踪使用的Cre驱动系（Myh11-Cre、Pdgfra-CreER等）及他莫昔芬处理方案 人PVAT样本来源及处理（冠状动脉旁路移植术患者，男，平均年龄64岁）
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证主动脉PVAT是否具有经典棕色脂肪的表型特征，包括高表达UCP1、对寒冷暴露的响应、依赖EBF2以及抵抗饮食诱导的炎症。
通过组织学染色（H&E）和实时定量PCR检测胸主动脉PVAT与iBAT和iWAT的基因表达；对小鼠进行寒冷暴露（4°C）或热中性（30°C）处理；使用Ebf2敲除小鼠（Ebf2ΔAdipoq）检测PVAT形态和基因表达；用西方饮食喂养小鼠16周，检测PVAT和eWAT的炎症基因表达。
确定围产期主动脉中存在的细胞类型，特别是成纤维细胞亚群及其空间定位。
对E18和P3小鼠胸主动脉（含外膜）进行单细胞RNA测序，并通过免疫荧光和原位杂交验证细胞类型标记基因的表达和定位。
纯化不同的成纤维细胞亚群和血管平滑肌细胞，评估其体外成脂分化能力。
通过FACS从P3小鼠主动脉中分离祖细胞、前脂肪细胞、中间细胞和SMC，进行批量RNA测序和体外成脂分化实验，用Bodipy染色量化脂质积累。
通过遗传谱系追踪确定SMC和成纤维细胞在围产期是否贡献于血管周围脂肪细胞的形成。
使用Myh11-Cre、Pdgfra-CreER、Vipr2-Cre和Penk-Cre谱系追踪小鼠，标记SMC或成纤维细胞，检测其是否生成脂肪细胞。
确定PVAT祖细胞是否稳定地定向于产热谱系，并鉴定保守的基因程序。
从PVAT和iWAT中分离祖细胞和前脂肪细胞，体外诱导成脂分化，检测产热基因（Dio2、Ucp1）表达；对新鲜分选的细胞进行批量RNA-seq，比较基因表达并分析通路富集。
检查成年小鼠PVAT中是否存在与发育期类似的细胞类型，特别是发现新的SMC亚群。
对13周龄小鼠胸主动脉的基质血管组分进行单细胞RNA测序，鉴定细胞群，并通过FACS纯化和批量RNA-seq验证。
确定SMC2细胞是否能在体内贡献于血管周围脂肪细胞的形成。
对FACS纯化的成年细胞进行体外成脂分化实验；用Myh11-Cre; tdTomato小鼠在罗格列酮处理下追踪SMC谱系；用Trpv1-Cre; GFP小鼠检测冷暴露或热中性条件下SMC2细胞的贡献。
确定人类主动脉PVAT中是否存在与小鼠类似的细胞类型，包括成纤维细胞和前脂肪细胞以及SMC样细胞。
对3名人类主动脉PVAT样本进行单核RNA测序，分析细胞类型，并重新分析公开的人类深颈部棕色脂肪数据集。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 他莫昔芬 | Sigma | T5648 |
| 罗格列酮 | Cayman | -- | |
| 免疫荧光 | PLIN1抗体 | CST | 3470 |
| PDGFRa抗体 | Novus Biologicals | AF1062 | |
| MYH11抗体 | Abcam | ab53219 | |
| PPARG抗体 | Invitrogen | MA5-14889 | |
| RFP抗体 | VWR Scientific | 600-401-379 | |
| GFP抗体 | Abcam | AB6673 | |
| CD200抗体 | Novus Biologicals | AF2724 | |
| ACTA2抗体 | Sigma | A2547 | |
| TAGLN抗体 | Abcam | ab10135 | |
| RNA原位杂交 | RNAscope探针 | Advanced Cell Diagnostics | 323100, 323120 |
| RNA提取 | TRIzol | Invitrogen | -- |
| Purelink RNA柱 | Fisher | -- | |
| PicoPure RNA分离试剂盒 | Fisher | -- | |
| RT-qPCR | High-Capacity cDNA合成试剂盒 | ABI | -- |
| SYBR green | Applied Biosystems | -- | |
| 细胞培养 | Bodipy 493/503 | Invitrogen | D3922 |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | 62249 | |
| 地塞米松 | Sigma | D4902 | |
| 异丁基甲基黄嘌呤 | Sigma | I7018 | |
| 吲哚美辛 | -- | -- | |
| 胰岛素 | -- | -- | |
| 三碘甲状腺原氨酸 | -- | -- | |
| 细胞消化 | 胶原酶D | Roche | -- |
| 分散酶II | Roche | -- | |
| 流式细胞术 | 流式抗体 | Biolegend, Biorad, Sino Biological, BD Biosciences | -- |
| 单细胞测序 | 10X Genomics Chromium | -- | -- |
| 单核测序 | 10X Genomics v3.1 Next GEM试剂盒 | 10x Genomics | -- |
| 测序 | Illumina HiSeq 4000 | Illumina | -- |
| Illumina NovaSeq 6000 | Illumina | -- | |
| 显微镜 | Leica TCS SP8共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| Keyence倒置显微镜（BZX-710） | Keyence | -- | |
| 流式分选 | BD FACS Aria细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | 小鼠品系（C57/Bl6、CD1）、年龄（胚胎、新生、成年）、性别；饲养温度（22°C或30°C）；冷暴露条件（4°C，1周）；饮食（正常或西方饮食） 阅读提示：Methods: Mice; Figure legends for Figs. 1C-D, 1G-I |
| 单细胞/单核RNA测序 | 样本准备（主动脉消化、细胞分选）；建库试剂盒（10X v2/v3）；测序平台（HiSeq/NovaSeq）；分析软件及参数（Seurat、CellRanger） 阅读提示：Methods: scRNA Seq; Human Aortic PVAT snRNA Seq |
| FACS分选 | 抗体克隆、稀释度、门控策略（标记基因组合）；分选细胞群定义 阅读提示：Methods: Flow Cytometry and Sorting; Extended Data Fig. 2A, 5F |
| 体外成脂分化 | 细胞接种密度（10,000-30,000/well）、培养时间、诱导液组成及作用时间 阅读提示：Methods: Cell Culture; Adipogenesis Assays |
| 遗传谱系追踪 | Cre驱动系（Myh11-Cre、Pdgfra-CreER等）、报告基因、他莫昔芬给药方案（剂量、天数）、追踪时间点 阅读提示：Methods: Mice; Figure legends for Fig. 4, 7B-C, Extended Data Fig. 6 |
| 人样本PVAT核分离 | 患者特征（年龄、性别、BMI）、组织来源（冠状动脉旁路移植术）；核提取缓冲液组成、离心条件 阅读提示：Methods: Isolation of human aortic PVAT nuclei |
