建立糖尿病溃疡大鼠模型
构建糖尿病溃疡模型,用于评估APS的疗效和机制。
通过腹腔注射STZ(60 mg/kg)诱导糖尿病,血糖>16.7 mM的 rats 视为糖尿病;8周后制造全层圆形伤口(直径约1 cm),形成糖尿病溃疡模型。
Astragalus polysaccharide improves diabetic ulcers by promoting M2-polarization of macrophages to reduce excessive inflammation via the β-catenin/ NF-κB axis at the late phase of wound-healing.
包含体外细胞实验(巨噬细胞分离培养)和体内大鼠模型,并通过通路抑制剂进行机制验证。
糖尿病溃疡大鼠模型 分离的CD68+巨噬细胞
糖尿病模型建立:STZ 60 mg/kg 腹腔注射,血糖>16.7 mM 视为糖尿病 APS 给药剂量:低、中、高剂量(具体浓度见补充表1) β-catenin 抑制剂 PNU-74654 和 NF-κB 抑制剂 BAY11-7082 的使用浓度及给药方案 伤口愈合率检测时间点:第0、3、7、10天 样本量:每组大鼠数量(n=10或n=5)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建糖尿病溃疡模型,用于评估APS的疗效和机制。
通过腹腔注射STZ(60 mg/kg)诱导糖尿病,血糖>16.7 mM的 rats 视为糖尿病;8周后制造全层圆形伤口(直径约1 cm),形成糖尿病溃疡模型。
检测APS不同剂量对糖尿病溃疡伤口愈合率的影响。
以不同浓度的APS(低、中、高)腹腔注射治疗糖尿病溃疡大鼠,在第0、3、7、10天拍摄伤口并计算愈合率。
评估APS对伤口愈合晚期炎症反应的影响。
通过RT-PCR、ELISA和IHC检测伤口组织中促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)和抗炎因子(IL-10、IL-4)的表达。
利用生物信息学和分子对接预测APS的潜在靶基因。
利用GeneCards、KEGG、Uniprot等数据库预测APS靶基因,并通过AutoDock进行分子对接预测APS与TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、NF-κB、GSK-3β、β-catenin、RSPO3的结合。
验证APS对β-catenin/NF-κB相关信号通路蛋白表达的影响。
通过RT-PCR、Western blot和IHC检测伤口组织中β-catenin、RSPO3、GSK-3β、NF-κB的表达。
验证β-catenin和NF-κB在APS促进伤口愈合和抑制炎症中的作用。
使用β-catenin抑制剂PNU-74654和NF-κB抑制剂BAY11-7082单独或与H-APS联合治疗糖尿病溃疡大鼠,检测伤口愈合率、炎症因子和蛋白表达。
评估APS对巨噬细胞M1/M2极化的影响。
通过免疫荧光染色和流式细胞术检测伤口组织中CD68+/CD86+(M1型)和CD68+/CD163+(M2型)巨噬细胞比例,并通过流式分选分离M1和M2巨噬细胞,ELISA检测其分泌的细胞因子。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型建立 | 链脲佐菌素 | sigma | S0130 |
| 动物实验 | 碱性成纤维细胞生长因子 | Nanhai Langtide Pharmaceutical Co., Ltd | -- |
| 黄芪多糖 | Beijing Desite Technology Development Co., Ltd | DH0109 | |
| PNU-74654 | MedChemExpress | HY-101130 | |
| BAY11-7082 | MedChemExpress | HY-13453 | |
| RNA提取 | MolPure® 细胞/组织总RNA提取试剂盒 | YEASON | 19221ES50 |
| 逆转录 | Hifair® V一步法RT-gDNA消化超混合液(qPCR用) | YEASON | 11142 |
| RT-PCR | 一步法qRT-PCR酶混合液 | YEASON | 13197 ES |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013C |
| 蛋白酶抑制剂 | Beyotime | P1005 | |
| 钒酸钠 | Sangon biotech | A602444 | |
| β-catenin抗体 | CST | 8480 | |
| RSPO3抗体 | Proteintech | 17193-1-AP | |
| GSK-3β抗体 | Proteintech | 22104-1-AP | |
| NF-κB抗体 | Proteintech | 10745-1-AP | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-1g | |
| HRP标记的山羊抗兔二抗 | Beyotime | A0208 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠二抗 | Beyotime | A0216 | |
| ECL化学发光检测试剂盒 | Yeasen | 36208ES76 | |
| 免疫组化 | IL-1β抗体 | abcam | ab9722 |
| IL-6抗体 | abcam | ab9324 | |
| IL-10抗体 | abcam | ab192271 | |
| TNF-α抗体 | abcam | ab1793 | |
| β-catenin抗体 | abcam | ab32572 | |
| RSPO3抗体 | bioss | bs-18877R-1 | |
| GSK-3β抗体 | abcam | ab93926 | |
| NF-κB抗体 | abcam | ab230846 | |
| 免疫荧光 | CD68抗体 | abcam | ab283654 |
| CD86抗体 | abcam | ab244583 | |
| CD163抗体 | abcam | ab182422 | |
| 流式分选 | 胶原酶 | univ | S10054-100 mg |
| ELISA | IL-4 ELISA试剂盒 | invitrogen | ERA30RB |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Neobioscience | ERC003.96 | |
| IL-1β ELISA试剂盒 | Neobioscience | ERC007.96 | |
| IL-10 ELISA试剂盒 | Neobioscience | ERC004.96 | |
| TNF-α ELISA试剂盒 | Neobioscience | ERC102A.96 | |
| 动物实验 | ACCU-CHEK Active血糖仪 | ROCHE | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 糖尿病溃疡模型建立 | STZ剂量(60 mg/kg)、给药途径(腹腔注射)、糖尿病判定标准(血糖>16.7 mM)、大鼠品系/性别/年龄/体重(SD大鼠,雄性,6-8周,200-230g)、饲养条件、伤口大小(直径约1cm) 阅读提示:见Methods章节2.1和2.2 |
| APS治疗 | APS剂量(低、中、高)具体浓度、给药途径(腹腔注射)、给药时间点(从伤口制造后开始)、给药频率(文中未明确说明) 阅读提示:见Methods 2.2 和 Supplementary Table 1 |
| 机制验证实验 | β-catenin抑制剂(PNU-74654)剂量、NF-κB抑制剂(BAY11-7082)剂量、给药途径、给药时间 阅读提示:见Methods 2.3 和 Supplementary Table 2 |
| 伤口愈合率评估 | 检测时间点(第0、3、7、10天)、图像分析软件(Image J)、计算方式 阅读提示:见Methods 3.1 |
| 炎症因子检测 | 检测方法(RT-PCR、ELISA、IHC)、取样时间点(第10天)、引物序列(表1)、抗体稀释倍数、样本量(n=10或n=5) 阅读提示:见Methods 3.1.1, 4.1, 抗体信息在2.1节及图注 |
| 巨噬细胞表型检测 | 抗体(CD68、CD86、CD163)稀释倍数、检测方法(免疫荧光、FCM)、样本量(n=5或n=3)、分离方法(胶原酶消化、免疫磁珠分选) 阅读提示:见Methods 3.2, 4.1, 4.2 |