黄芪多糖通过β-catenin/NF-κB轴在伤口愈合晚期促进巨噬细胞M2型极化以减少过度炎症,从而改善糖尿病溃疡

Astragalus polysaccharide improves diabetic ulcers by promoting M2-polarization of macrophages to reduce excessive inflammation via the β-catenin/ NF-κB axis at the late phase of wound-healing.

作者信息Zhang Zhen, Shan Wei, Wang Yunfei, Xing Jie, Xu Jienan, Shen Yiting, Xiao Wen, Guo Shuyu, Liang Yue, Wang Xuanyu, Zhong Yumei, Que Huafa
PMID38390059
期刊Heliyon
发布时间2024-02-05
DOI10.1016/j.heliyon.2024.e24644

实验完整度

包含体外细胞实验(巨噬细胞分离培养)和体内大鼠模型,并通过通路抑制剂进行机制验证。

主要模型

糖尿病溃疡大鼠模型 分离的CD68+巨噬细胞

重点核对

糖尿病模型建立:STZ 60 mg/kg 腹腔注射,血糖>16.7 mM 视为糖尿病 APS 给药剂量:低、中、高剂量(具体浓度见补充表1) β-catenin 抑制剂 PNU-74654 和 NF-κB 抑制剂 BAY11-7082 的使用浓度及给药方案 伤口愈合率检测时间点:第0、3、7、10天 样本量:每组大鼠数量(n=10或n=5)

摘要

民族药理学相关性:黄芪多糖(APS)是黄芪中最具生物活性的成分,在传统中医中用于治疗糖尿病(DM)相关的慢性伤口已有数十年。这种草药具有抗炎作用。我们的研究证明,APS在糖尿病溃疡伤口愈合晚期可以减少过度炎症。研究目的:阐明APS在糖尿病溃疡伤口愈合晚期通过减少过度炎症促进伤口愈合的分子机制。方法和材料:通过腹腔注射链脲佐菌素(60 mg/kg)建立糖尿病溃疡大鼠模型。我们通过测量伤口愈合率检测APS对糖尿病溃疡的调节作用。使用生物信息学预测APS的靶基因,并使用自对接预测APS与靶基因的结合。研究了免疫组织化学、酶联免疫吸附测定、Western blot、免疫荧光染色、流式细胞术和流式细胞分选。结果:结果表明,APS促进了糖尿病大鼠伤口愈合晚期伤口愈合,并抑制了过度炎症。机制发现表明,APS促进β-catenin和Rspo3的表达,同时抑制NF-κB和GSK-3β的表达,这导致M1型巨噬细胞转化为M2型巨噬细胞,从而减少糖尿病溃疡伤口愈合晚期的过度炎症。结论:我们发现了一个有趣的发现,APS通过β-catenin/NF-κB轴促进巨噬细胞向M2型极化,以减少伤口愈合晚期的过度炎症。因此,APS可能是临床上治疗糖尿病溃疡的一种有前景的药物。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
黄芪多糖在糖尿病溃疡伤口愈合晚期如何通过调节炎症和巨噬细胞极化来促进伤口愈合?
核心机制
APS通过抑制GSK-3β并上调RSPO3,促进β-catenin表达,进而抑制NF-κB,驱动巨噬细胞从促炎M1型向抗炎M2型极化,从而减轻伤口愈合晚期的过度炎症。
主要证据
在STZ诱导的糖尿病溃疡大鼠模型中,APS剂量依赖地促进伤口愈合,减少M1型巨噬细胞、增加M2型巨噬细胞,并调节β-catenin/NF-κB轴及炎症因子表达;使用β-catenin抑制剂和NF-κB抑制剂进一步验证了该机制。
研究意义
APS可能成为临床上治疗糖尿病溃疡的有前景的药物,值得进一步研究。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

建立糖尿病溃疡大鼠模型

构建糖尿病溃疡模型,用于评估APS的疗效和机制。

通过腹腔注射STZ(60 mg/kg)诱导糖尿病,血糖>16.7 mM的 rats 视为糖尿病;8周后制造全层圆形伤口(直径约1 cm),形成糖尿病溃疡模型。

2

评估APS对糖尿病溃疡的疗效

检测APS不同剂量对糖尿病溃疡伤口愈合率的影响。

以不同浓度的APS(低、中、高)腹腔注射治疗糖尿病溃疡大鼠,在第0、3、7、10天拍摄伤口并计算愈合率。

3

检测炎症因子表达

评估APS对伤口愈合晚期炎症反应的影响。

通过RT-PCR、ELISA和IHC检测伤口组织中促炎因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)和抗炎因子(IL-10、IL-4)的表达。

4

预测APS靶基因并进行分子对接

利用生物信息学和分子对接预测APS的潜在靶基因。

利用GeneCards、KEGG、Uniprot等数据库预测APS靶基因,并通过AutoDock进行分子对接预测APS与TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、NF-κB、GSK-3β、β-catenin、RSPO3的结合。

5

验证信号通路蛋白表达

验证APS对β-catenin/NF-κB相关信号通路蛋白表达的影响。

通过RT-PCR、Western blot和IHC检测伤口组织中β-catenin、RSPO3、GSK-3β、NF-κB的表达。

6

使用通路抑制剂进行功能验证

验证β-catenin和NF-κB在APS促进伤口愈合和抑制炎症中的作用。

使用β-catenin抑制剂PNU-74654和NF-κB抑制剂BAY11-7082单独或与H-APS联合治疗糖尿病溃疡大鼠,检测伤口愈合率、炎症因子和蛋白表达。

7

检测巨噬细胞表型极化

评估APS对巨噬细胞M1/M2极化的影响。

通过免疫荧光染色和流式细胞术检测伤口组织中CD68+/CD86+(M1型)和CD68+/CD163+(M2型)巨噬细胞比例,并通过流式分选分离M1和M2巨噬细胞,ELISA检测其分泌的细胞因子。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
链脲佐菌素sigmaS0130
碱性成纤维细胞生长因子Nanhai Langtide Pharmaceutical Co., Ltd--
黄芪多糖Beijing Desite Technology Development Co., LtdDH0109
PNU-74654MedChemExpressHY-101130
BAY11-7082MedChemExpressHY-13453
MolPure® 细胞/组织总RNA提取试剂盒YEASON19221ES50
Hifair® V一步法RT-gDNA消化超混合液(qPCR用)YEASON11142
一步法qRT-PCR酶混合液YEASON13197 ES
RIPA裂解液BeyotimeP0013C
蛋白酶抑制剂BeyotimeP1005
钒酸钠Sangon biotechA602444
β-catenin抗体CST8480
RSPO3抗体Proteintech17193-1-AP
GSK-3β抗体Proteintech22104-1-AP
NF-κB抗体Proteintech10745-1-AP
GAPDH抗体Proteintech60004-1-1g
HRP标记的山羊抗兔二抗BeyotimeA0208
HRP标记的山羊抗小鼠二抗BeyotimeA0216
ECL化学发光检测试剂盒Yeasen36208ES76
IL-1β抗体abcamab9722
IL-6抗体abcamab9324
IL-10抗体abcamab192271
TNF-α抗体abcamab1793
β-catenin抗体abcamab32572
RSPO3抗体biossbs-18877R-1
GSK-3β抗体abcamab93926
NF-κB抗体abcamab230846
CD68抗体abcamab283654
CD86抗体abcamab244583
CD163抗体abcamab182422
胶原酶univS10054-100 mg
IL-4 ELISA试剂盒invitrogenERA30RB
IL-6 ELISA试剂盒NeobioscienceERC003.96
IL-1β ELISA试剂盒NeobioscienceERC007.96
IL-10 ELISA试剂盒NeobioscienceERC004.96
TNF-α ELISA试剂盒NeobioscienceERC102A.96
ACCU-CHEK Active血糖仪ROCHE--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
糖尿病溃疡模型建立
STZ剂量(60 mg/kg)、给药途径(腹腔注射)、糖尿病判定标准(血糖>16.7 mM)、大鼠品系/性别/年龄/体重(SD大鼠,雄性,6-8周,200-230g)、饲养条件、伤口大小(直径约1cm)
阅读提示:见Methods章节2.1和2.2
APS治疗
APS剂量(低、中、高)具体浓度、给药途径(腹腔注射)、给药时间点(从伤口制造后开始)、给药频率(文中未明确说明)
阅读提示:见Methods 2.2 和 Supplementary Table 1
机制验证实验
β-catenin抑制剂(PNU-74654)剂量、NF-κB抑制剂(BAY11-7082)剂量、给药途径、给药时间
阅读提示:见Methods 2.3 和 Supplementary Table 2
伤口愈合率评估
检测时间点(第0、3、7、10天)、图像分析软件(Image J)、计算方式
阅读提示:见Methods 3.1
炎症因子检测
检测方法(RT-PCR、ELISA、IHC)、取样时间点(第10天)、引物序列(表1)、抗体稀释倍数、样本量(n=10或n=5)
阅读提示:见Methods 3.1.1, 4.1, 抗体信息在2.1节及图注
巨噬细胞表型检测
抗体(CD68、CD86、CD163)稀释倍数、检测方法(免疫荧光、FCM)、样本量(n=5或n=3)、分离方法(胶原酶消化、免疫磁珠分选)
阅读提示:见Methods 3.2, 4.1, 4.2