重组病毒的构建
利用CRISPR-Cas9和同源重组技术，构建表达SVA VP2蛋白的PRV重组病毒。
将SVA VP2基因插入pEGFP-gI/28K载体，与靶向gE的sgRNA共转染BHK-21细胞，随后感染PRV-XJ-ΔTK，经三轮纯化获得重组病毒rPRV-XJ-ΔTK/gE/gI-VP2。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
共表达塞内卡病毒A VP2蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及免疫原性分析
The Construction and Immunogenicity Analyses of a Recombinant Pseudorabies Virus with Senecavirus A VP2 Protein Coexpression.
实验完整度
高包含重组病毒构建与体外表征、小鼠安全性与免疫原性评估、PRV攻毒保护及SVA感染模型与保护效果等至少两个独立证据层级，并含功能与机制验证。
主要模型
BHK-21细胞 BALB/c小鼠模型
重点核对
重组病毒rPRV-XJ-ΔTK/gE/gI-VP2的构建与纯化（CRISPR-Cas9和同源重组） 重组病毒在BHK-21细胞中的增殖动力学和斑块形成能力 小鼠免疫剂量（105、106、107 TCID50） PRV-XJ攻毒剂量（200 μL 105 TCID50） SVA攻毒剂量（50 μL 105 TCID50，鼻内接种）
摘要
塞内卡病毒A（SVA）相关的猪特发性水疱病（PIVD）和伪狂犬病（PR）是高度传染性的猪病，对中国养猪业构成重大威胁。由于目前尚无针对SVA的有效商业疫苗，该病毒已在中国广泛传播，且在过去十年中其致病性有所增强。本研究以伪狂犬病毒（PRV）变异株XJ为亲本病毒，通过删除TK/gE/gI基因并共表达SVA VP2，构建了名为rPRV-XJ-ΔTK/gE/gI-VP2的重组株。该重组株能在BHK-21细胞中稳定增殖并表达外源蛋白VP2，且病毒粒子形态与亲本株相似。rPRV-XJ-ΔTK/gE/gI-VP2对BALB/c小鼠安全有效，可诱导针对PRV和SVA的高水平中和抗体，对强毒PRV株提供100%保护。组织病理学检查和定量PCR（qPCR）检测表明，SVA可通过鼻内接种感染小鼠，而用rPRV-XJ-ΔTK/gE/gI-VP2免疫小鼠可显著减少SVA病毒拷贝并减轻心脏和肝脏的病理炎症变化。安全性和免疫原性评估表明，rPRV-XJ-ΔTK/gE/gI-VP2有望成为针对PRV和SVA的候选疫苗。重要性：本研究首次报道了带有SVA的重组PRV的构建，所得病毒rPRV-XJ-ΔTK/gE/gI-VP2可在模型小鼠中诱导针对PRV和SVA的高水平中和抗体。这些发现为评估rPRV-XJ-ΔTK/gE/gI-VP2作为猪用疫苗的有效性提供了有价值的见解。此外，本研究报道了小鼠中短暂的SVA感染，qPCR检测显示SVA 3D基因拷贝在感染后3至6天达到峰值，并在感染后14天降至灵敏度阈值以下。该基因拷贝在心脏、肝脏、脾脏和肺组织中更为规律且水平更高。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否利用PRV载体共表达SVA VP2构建重组病毒，并评估其对PRV和SVA的免疫保护效果？
- 核心机制
- 重组病毒通过删除TK/gE/gI基因降低毒力，同时表达SVA VP2蛋白，诱导针对PRV和SVA的特异性体液和细胞免疫应答，从而提供保护。
- 主要证据
- 在小鼠模型中，重组病毒诱导高水平的PRV和SVA中和抗体，提供100%的PRV攻毒保护，并减少SVA病毒载量和病理损伤。
- 研究意义
- 该重组病毒作为PRV和SVA的二价候选疫苗，为猪用疫苗评估提供参考。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
重组病毒的体外表征
验证重组病毒的遗传稳定性、蛋白表达、生长特性及病毒粒子形态。
通过PCR检测重组病毒21代传代中VP2插入及gE/gI/TK缺失；Western blot和IFA检测VP2表达；一步生长曲线和斑块试验评估增殖能力；透射电镜观察病毒粒子形态。
小鼠安全性评估
评估重组病毒对小鼠的毒力、 shedding和炎症反应。
将不同剂量重组病毒接种BALB/c小鼠，观察存活率、临床症状；qPCR检测病毒脱落；ELISA检测IL-6和TNF-α；H&E染色观察脑组织病理。
小鼠免疫原性评估
评估重组病毒诱导的体液和细胞免疫应答。
免疫小鼠后，检测PRV gB和SVA VP2特异性抗体、PRV和SVA中和抗体；流式细胞术分析T细胞亚群；ELISA检测IFN-γ、IL-2、IL-4；脾淋巴细胞增殖试验。
攻毒保护试验
评估重组病毒对PRV强毒株和SVA攻击的保护效果。
免疫后28天，用PRV-XJ攻毒观察存活率和病理；用SVA鼻内接种，检测组织病毒载量和病理变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 12100046 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099133C | |
| 重组病毒构建 | 脂质体转染试剂3000 | Thermo | L3000015 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 小鼠抗β-肌动蛋白单克隆抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体 | Bio-Rad | 5178-2504 | |
| Clarity Western ECL底物 | Bio-Rad | 170-5061 | |
| 免疫荧光 | Corallite 594标记的山羊抗小鼠IgG | Proteintech | SA00013-3 |
| DAPI | Solarbio | C0060 | |
| ELISA | ID.vet商业ELISA试剂盒 | ID.vet | -- |
| Neobioscience商业ELISA试剂盒 | Neobioscience | -- | |
| 重组蛋白表达 | 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 | Solarbio | -- |
| ELISA | TMB底物 | Solarbio | -- |
| 流式细胞术 | FITC标记抗小鼠CD3抗体 | Biolegend | 100204 |
| APC标记抗小鼠CD4抗体 | Biolegend | 100412 | |
| PE标记抗小鼠CD8a抗体 | Biolegend | 100708 | |
| 脾淋巴细胞增殖试验 | CCK-8试剂盒 | Beyotime | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | TaKaRa | -- |
| 逆转录 | Prime Script II 第一链cDNA合成试剂盒 | TaKaRa | -- |
| qPCR | TB Green预混Ex Taq II | TaKaRa | -- |
| Lightcycler 96实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| 病毒纯化 | 无缝克隆试剂盒 | Beyotime | -- |
| 质粒提取 | 无内毒素质粒小提试剂盒II | Omega | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 重组病毒构建 | 转染质粒剂量（2.5 μg），转染试剂（Lipofectamine 3000），细胞系（BHK-21），感染MOI（未明确） 阅读提示：见Materials and Methods中'Construction of the recombinant virus' |
| 病毒增殖动力学 | MOI=0.1，时间点（2-72h），TCID50测定方法（Reed-Muench） 阅读提示：见Materials and Methods中'Replication kinetics' |
| 小鼠安全性 | 小鼠品系（BALB/c雌性6周龄），剂量（105、106、107 TCID50），观察期14天 阅读提示：见Materials and Methods中'Safety and immunogenicity assessment in mice' |
| 免疫原性 | 免疫剂量（106 TCID50），加强免疫时间（14 dpv），中和抗体检测方法（噬斑减少），流式细胞术染色抗稀释度（1:250） 阅读提示：见Materials and Methods中'Mouse immunization and challenge experiment'和'Flow cytometry analysis' |
| 攻毒保护 | 攻毒剂量（PRV 200 μL 105 TCID50；SVA 50 μL 105 TCID50），攻毒途径（足垫/鼻内），样本采集时间点（1、3、6、10、14、21天） 阅读提示：见Materials and Methods中'Mouse immunization and challenge experiment' |