LFS对牙龈成纤维细胞炎症反应的调控
验证LFS是否抑制P. gingivalis LPS诱导的HGF炎症因子表达和分泌。
HGF用1 μg/mL P. gingivalis LPS刺激24小时，同时用LFS（0, 1, 5 μM）干预，检测炎症因子mRNA、蛋白和分泌水平。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
萝卜硫素通过NRF2依赖性调控牙龈卟啉单胞菌诱导的炎症反应和骨稳态来缓解牙周炎
Sulforaphene Mitigates Periodontitis by NRF2-Dependent Regulation of P. gingivalis-Induced Inflammatory Response and Bone Homeostasis.
实验完整度
高包含体外细胞实验（HGF、BMDM、PDLC）、体内动物模型（小鼠结扎牙周炎模型、Nrf2−/−小鼠）、细菌实验及转录组测序和分子对接，包含功能验证和机制验证。
主要模型
人牙龈成纤维细胞（HGF） 骨髓来源巨噬细胞（BMM）诱导的破骨细胞 牙周膜细胞（PDLC） 小鼠牙周炎模型（C57BL/6，Nrf2+/+与Nrf2−/−）
重点核对
LFS浓度：1和5 μM（体外） IL-1β浓度：10 ng/mL（模拟炎症环境） LFS给药剂量：20 mg/kg/天腹腔注射（体内） P. gingivalis菌株：ATCC 33277 小鼠品系和分组：8周龄雄性C57BL/6，Nrf2+/+和Nrf2−/−
摘要
牙周炎是一种常见的慢性炎症性疾病，与多种全身性疾病密切相关。包括机械清创和抗生素在内的常规治疗通常不足以完全解决炎症或恢复骨稳态。萝卜硫素（LFS）在萝卜籽油和莱菔子（一种传统中草药）中含量丰富，并已被认识到其抗炎潜力。在此，我们表明LFS显著减弱人牙龈成纤维细胞分泌促炎细胞因子（IL-1β、IL-6和IL-8），并在IL-1β诱导的炎症条件下抑制破骨细胞分化，且不影响牙周膜细胞（PDLC）的成骨能力。机制上，LFS激活NRF2通路，其对牙槽骨丢失的保护作用在Nrf2+/+小鼠中明显，但在Nrf2−/−小鼠中则不明显。值得注意的是，LFS还被发现能抑制牙龈卟啉单胞菌的生长、毒力和生物膜形成，并减少其在体内龈下微生物群中的丰度。总之，这些发现将LFS确定为一种有效的NRF2依赖性调节剂，为预防和治疗牙周炎提供了一种有前景的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- LFS是否通过NRF2依赖性机制缓解牙龈卟啉单胞菌诱导的牙周炎炎症和骨丢失？
- 核心机制
- LFS通过结合KEAP1蛋白（预测与Gly-367和Val-606形成氢键）激活NRF2通路，从而抑制破骨细胞分化和炎症反应。
- 主要证据
- 体外实验显示LFS抑制HGF炎症因子分泌和BMM破骨细胞分化；体内实验显示LFS在Nrf2+/+小鼠中减轻骨丢失和炎症，但在Nrf2−/−小鼠中无效。
- 研究意义
- LFS作为一种多靶点NRF2激活剂，为预防和治疗牙周炎提供了一种有前景的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
LFS对破骨细胞分化的影响
验证LFS是否抑制RANKL诱导的BMM破骨细胞分化及其功能。
BMM用M-CSF和RANKL诱导破骨细胞分化，同时用LFS（0, 1, 5 μM）处理，通过TRAP染色、F-actin环染色、qPCR和Western blot检测破骨细胞形成和相关基因表达。
LFS在炎症环境下对破骨细胞分化的影响
验证LFS在IL-1β模拟的炎症微环境中是否仍能抑制破骨细胞分化。
BMM在RANKL诱导的同时加入IL-1β（10 ng/mL）和LFS（0, 1, 5 μM），通过TRAP染色、qPCR和Western blot检测破骨细胞形成。
LFS对PDLC成骨分化的影响
验证LFS是否不影响PDLC的成骨分化。
PDLC在成骨诱导培养基中培养，同时用LFS（0, 1, 5 μM）处理，通过ALP染色、qPCR和Western blot检测成骨标志物。
LFS对体内牙周炎骨丢失的缓解作用
验证LFS是否在体内减轻结扎诱导的牙周炎骨丢失。
建立小鼠丝线结扎牙周炎模型，每天腹腔注射LFS（20 mg/kg）一周，通过Micro-CT、HE染色、TRAP染色和免疫组化评估骨丢失和炎症。
Nrf2在LFS保护作用中的必要性验证
验证LFS的保护作用是否依赖NRF2通路。
使用Nrf2−/−小鼠建立牙周炎模型，同样给予LFS治疗，通过Micro-CT、TRAP染色和免疫组化比较骨丢失和炎症。
LFS对P. gingivalis生长、毒力和生物膜的影响
验证LFS是否直接抑制P. gingivalis的生长、毒力因子表达和生物膜形成。
P. gingivalis用LFS（0, 1, 5, 10 μM）处理，检测生长曲线、毒力基因（fimA, kgp）表达、生物膜形成（结晶紫染色、CLSM、SEM）。
RNA-seq和分子对接揭示机制
探索LFS影响破骨细胞分化的转录组变化及与KEAP1的结合模式。
Raw264.7细胞在RANKL诱导下用或不用LFS处理，进行RNA-seq分析；通过分子对接预测LFS与KEAP1的结合。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | α-MEM培养基 | Hyclone | -- |
| 胎牛血清 | Biological Industries | -- | |
| 细胞因子 | 巨噬细胞集落刺激因子 | Novoprotein | -- |
| 核因子κB受体活化因子配体 | -- | -- | |
| ELISA | IL-1β ELISA试剂盒 | NeoBioscience | EHC002b |
| IL-6 ELISA试剂盒 | NeoBioscience | EHC007 | |
| IL-8 ELISA试剂盒 | NeoBioscience | EHC008 | |
| TRAP染色 | TRAP染色试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- |
| 免疫荧光 | TRITC标记的鬼笔环肽 | Yeasen | -- |
| DAPI | Beyotime | -- | |
| 成骨诱导 | 地塞米松 | Sigma-Aldrich | -- |
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| β-甘油磷酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| ALP染色 | BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒 | Beyotime | -- |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Takara | -- |
| RNA定量 | Nanodrop 2000分光光度计 | ThermoFisher | -- |
| RT-qPCR | PrimeScript逆转录试剂盒 | Vazyme | -- |
| SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- | |
| QuantStudio 6实时荧光定量PCR仪 | Thermo | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 磷酸酶抑制剂 | Roche | -- | |
| 蛋白酶抑制剂 | Beyotime | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| SP7抗体 | Abcam | ab209484 | |
| OCN抗体 | Santa Cruz Biotechnology | b0822 | |
| NFATC1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | d0522 | |
| IL-1β抗体 | ABclonal Technology | A19635 | |
| IL-6抗体 | ABclonal Technology | A0286 | |
| CTSK抗体 | Bosterbio | PB9856 | |
| MMP9抗体 | Abcam | ab76003 | |
| ATP6V0D2抗体 | Proteintech | 333641-ap | |
| TRAP抗体 | Abcam | ab133238 | |
| β-微管蛋白抗体 | Abmart | M20045F | |
| HRP标记二抗 | Abbkine | -- | |
| ECL化学发光检测系统 | Millipore | -- | |
| 免疫组化 | IL-1β抗体 | Servicebio | GB300002 |
| IL-6抗体 | Servicebio | GB300007 | |
| TNF-α抗体 | ABclonal Technology | a11534 | |
| 药物处理 | 萝卜硫素 | De-Si-Te | DL0137 |
| 细菌培养 | 胰蛋白胨大豆肉汤 | Becton, Dickinson and Company | -- |
| 酵母提取物 | -- | -- | |
| L-半胱氨酸盐酸盐 | -- | -- | |
| 氯高铁血红素 | -- | -- | |
| 维生素K1 | -- | -- | |
| 羊血 | -- | -- | |
| 琼脂 | -- | -- | |
| Anoxomat Mark厌氧培养系统 | -- | -- | |
| 紫外分光光度计 | SHIMADZU | -- | |
| 微孔板读数 | 酶标仪 | BioTek Instruments | -- |
| 生物膜染色 | 结晶紫 | Shanghai Hushi | -- |
| 细菌活力检测 | LIVE/DEAD BacLight细菌活力试剂盒 | ThermoFisher | -- |
| 共聚焦显微镜 | 共聚焦激光扫描显微镜 | Leica Biosystems | -- |
| 扫描电镜 | 扫描电子显微镜 | Zeiss AG | -- |
| Micro-CT | 显微CT系统 | Bruker | Skyscan |
| 体视显微镜 | 体视显微镜 | Zeiss | -- |
| 分子对接 | AutoDock Vina | -- | -- |
| PyMOL | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞炎症模型 | HGF细胞来源、LPS浓度（1 μg/mL）、LFS浓度（1和5 μM）、刺激时间（24小时） 阅读提示：见2.2节，图1 |
| 破骨细胞分化 | BMM细胞提取方法、M-CSF和RANKL浓度（30 ng/mL和100 ng/mL）、LFS浓度（1和5 μM）、诱导时间（4-6天） 阅读提示：见2.3节，图2 |
| 炎症环境下破骨细胞分化 | IL-1β浓度（10 ng/mL）、LFS浓度（1和5 μM） 阅读提示：见3.3节，图4 |
| 成骨分化 | PDLC细胞来源和代数（3-7代）、成骨诱导剂浓度（10 nM地塞米松、50 μg/mL抗坏血酸、10 mM β-甘油磷酸）、LFS浓度（1和5 μM）、培养时间（7天） 阅读提示：见2.5节，图3 |
| 动物实验 | 小鼠品系和年龄（8周龄C57BL/6）、结扎方法（5-0丝线）、LFS剂量（20 mg/kg/天腹腔注射）、处理时间（1周）、分组和样本量（n=5或n=4） 阅读提示：见2.10节，图5和图7 |
| 细菌实验 | P. gingivalis菌株（ATCC 33277）、LFS浓度（0, 1, 5, 10 μM）、培养时间（24小时生长，48小时生物膜，72小时CLSM） 阅读提示：见2.13-2.16节，图8 |