发育性髋关节发育不良中滑膜组织和滑液中P物质和降钙素基因相关肽表达增加促进关节炎进展

Increasing expression of substance P and calcitonin gene-related peptide in synovial tissue and fluid contribute to the progress of arthritis in developmental dysplasia of the hip

作者信息Hui Wang, Xiang Zhang, Ji-Ye He, Xin-Feng Zheng, De Li, Zheng Li, Jun-Feng Zhu, Chao Shen, Gui-Quan Cai, Xiao-Dong Chen
PMID25578529
发布时间2015-01-12
DOI10.1186/s13075-014-0513-1

实验完整度

包含患者样本(滑膜、滑液)检测、原代滑膜细胞体外功能实验、NF-κB通路机制验证及抑制剂阻断实验,涉及临床样本、原代细胞和分子机制多个层面。

主要模型

患者滑膜组织和滑液样本(中度DDH、重度DDH、对照组) 原代成纤维样滑膜细胞(FLS,来源于中度DDH患者)

重点核对

DDH严重程度分组(中度、重度及对照组) SP和CGRP浓度(100 nM SP,1 nM CGRP) 处理时间(24小时和48小时) NF-κB抑制剂Bay 11–7085浓度(30 μM) 神经肽抑制剂L-703606(10 μM)和MK-3207(1 μM)

摘要

背景:发育性髋关节发育不良(DDH)是一种常见的肌肉骨骼疾病,疼痛和关节功能丧失是其主要病理特征。在本研究中,我们探讨了P物质(SP)和降钙素基因相关肽(CGRP)在DDH关节炎病理和炎症过程中可能参与和调节的机制。方法:收集诊断为不同严重程度DDH的患者和股骨颈骨折患者的血液、滑膜组织和滑液样本。通过免疫组织化学、实时PCR和酶联免疫吸附测定(ELISA)评估不同组滑膜和滑液(SF)中SP、CGRP和炎症细胞因子的水平。通过偏相关分析评估SF中神经肽与炎症细胞因子之间的相关性。通过实时PCR和ELISA在体外研究SP和CGRP对从中度DDH患者获得的滑膜细胞的促炎作用。通过Western blot分析和核因子κB(NF-κB)DNA结合测定评估这些作用的机制。结果:与中度DDH组和对照组相比,重度DDH组患者滑膜和SF中的神经肽和炎症细胞因子水平显著升高。在中度DDH样本中,SF中的SP与肿瘤坏死因子(TNF)-α相关,SF中的CGRP与TNF-α和白细胞介素(IL)-10相关。在重度DDH组中,SF中的SP与白细胞介素(IL)-1β、TNF-α和IL-10相关。SF中的CGRP与TNF-α相关。此外,SP可能通过激活NF-κB对滑膜细胞具有明显的促炎作用。结论:滑膜和SF中SP和CGRP的上调可能参与DDH关节炎的炎症过程。NF-κB通路的激活似乎在SP对滑膜细胞的促炎作用中不可或缺。这一原创发现可能表明DDH潜在的临床药物靶点和创新疗法的开发。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
探索SP和CGRP在DDH关节炎病理和炎症过程中的可能参与和调节机制。
核心机制
SP可能通过激活NF-κB通路对滑膜细胞发挥促炎作用,而CGRP的促炎作用可能不主要通过NF-κB通路介导。
主要证据
患者样本(IHC、RT-PCR、ELISA)显示重度DDH组SP和CGRP水平升高,且与炎症细胞因子相关;体外实验表明SP和CGRP上调滑膜细胞炎症因子表达,且SP的作用可被NF-κB抑制剂阻断。
研究意义
该发现可能为DDH提供潜在的临床药物靶点,并有助于开发创新疗法,如滑膜切除术、神经阻滞手术和关节内注射神经肽通路阻断剂。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

患者样本采集与分组

比较不同严重程度DDH患者与对照组滑膜和滑液中神经肽和炎症因子的表达差异

收集中度DDH(35例)、重度DDH(32例)和股骨颈骨折对照(15例)患者的滑膜、滑液和血液样本,通过Crowe分级和K-L分级进行分组。

2

检测滑膜和滑液中神经肽和炎症因子表达

明确SP、CGRP和炎症因子在不同组间的表达差异及相关性

通过IHC检测滑膜中SP和CGRP蛋白表达,RT-PCR检测mRNA表达,ELISA检测滑液中SP、CGRP、IL-1β、TNF-α和IL-10浓度,并进行相关性分析。

3

体外培养滑膜细胞并检测神经肽的促炎作用

验证SP和CGRP对滑膜细胞炎症因子表达的直接影响

从中度DDH患者滑膜分离FLS,用SP或CGRP处理,通过RT-PCR和ELISA检测炎症因子表达。

4

验证NF-κB通路在神经肽促炎作用中的角色

探究SP和CGRP是否通过激活NF-κB通路发挥促炎作用

通过Western blot检测磷酸化p65水平,NF-κB DNA结合实验检测NF-κB活性,并使用NF-κB抑制剂Bay 11–7085阻断NF-κB通路,观察对SP和CGRP促炎作用的影响。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
RNAlaterAmbionAM7021
SP抗体Abcamab14184
CGRP抗体Abcamab36001
EnVision系统Dako--
Image-Pro Plus 6.0版Media Cybernetics--
PrimeScript RT-PCR试剂盒TakaraDRR064A
ABI 7500序列检测系统Applied Biosystems--
人TNF-α ELISA试剂盒Xinbo ShengEHC103a
人IL-1β ELISA试剂盒Xinbo ShengEHC002b
人IL-10 ELISA试剂盒Xinbo ShengEHC009(H)
SP ELISA试剂盒Cayman Chemical589101
CGRP ELISA试剂盒Cayman Chemical583751
I型胶原酶Sigma-Aldrich--
胰蛋白酶-EDTAGibco/Life Technologies25300-054
DMEM/F-12培养基----
P物质Sigma-AldrichS6883
降钙素基因相关肽Sigma-AldrichC0167
p65抗体Cell Signaling Technology4767
辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗Cell Signaling Technology7074
β-actin抗体Cell Signaling Technology4967
增强化学发光试剂盒EMD Millipore--
TransAM NF-κB p65检测试剂盒Active Motif--
L-703606Sigma-Aldrich--
MK-3207Selleck Chemicals--
Bay 11-7085Sigma-Aldrich--
SPSSSPSS--
GraphPad Prism 5.01版GraphPad Software--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
患者样本采集与分组
DDH严重程度分组标准(Crowe分级和K-L分级),各组样本量,对照组纳入标准
阅读提示:Methods: Patients and materials; Table 1
滑膜和滑液神经肽和炎症因子检测
IHC染色切片数量、视野数、样本量;RT-PCR上样量、内参基因;ELISA试剂盒和稀释比例
阅读提示:Methods: Detection and analysis of substance P and CGRP; Gene expression detection; Enzyme-linked immunosorbent assay; Figure 1 legend
滑膜细胞体外培养和处理
细胞分离方法、培养条件、细胞代数、处理浓度(SP 100 nM,CGRP 1 nM)、处理时间(24/48小时)
阅读提示:Methods: Incubation of human fibroblast-like synoviocytes; Gene expression of inflammatory cytokines
NF-κB通路验证
Western blot样品量、抗体浓度、NF-κB DNA结合实验方法、抑制剂浓度(Bay 11-7085 30 μM,L-703606 10 μM,MK-3207 1 μM)
阅读提示:Methods: Western blot analysis; NF-κB activation assay; Enzyme-linked immunosorbent assay for role of NF-κB