患者样本采集与分组
比较不同严重程度DDH患者与对照组滑膜和滑液中神经肽和炎症因子的表达差异
收集中度DDH(35例)、重度DDH(32例)和股骨颈骨折对照(15例)患者的滑膜、滑液和血液样本,通过Crowe分级和K-L分级进行分组。
Increasing expression of substance P and calcitonin gene-related peptide in synovial tissue and fluid contribute to the progress of arthritis in developmental dysplasia of the hip
包含患者样本(滑膜、滑液)检测、原代滑膜细胞体外功能实验、NF-κB通路机制验证及抑制剂阻断实验,涉及临床样本、原代细胞和分子机制多个层面。
患者滑膜组织和滑液样本(中度DDH、重度DDH、对照组) 原代成纤维样滑膜细胞(FLS,来源于中度DDH患者)
DDH严重程度分组(中度、重度及对照组) SP和CGRP浓度(100 nM SP,1 nM CGRP) 处理时间(24小时和48小时) NF-κB抑制剂Bay 11–7085浓度(30 μM) 神经肽抑制剂L-703606(10 μM)和MK-3207(1 μM)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
比较不同严重程度DDH患者与对照组滑膜和滑液中神经肽和炎症因子的表达差异
收集中度DDH(35例)、重度DDH(32例)和股骨颈骨折对照(15例)患者的滑膜、滑液和血液样本,通过Crowe分级和K-L分级进行分组。
明确SP、CGRP和炎症因子在不同组间的表达差异及相关性
通过IHC检测滑膜中SP和CGRP蛋白表达,RT-PCR检测mRNA表达,ELISA检测滑液中SP、CGRP、IL-1β、TNF-α和IL-10浓度,并进行相关性分析。
验证SP和CGRP对滑膜细胞炎症因子表达的直接影响
从中度DDH患者滑膜分离FLS,用SP或CGRP处理,通过RT-PCR和ELISA检测炎症因子表达。
探究SP和CGRP是否通过激活NF-κB通路发挥促炎作用
通过Western blot检测磷酸化p65水平,NF-κB DNA结合实验检测NF-κB活性,并使用NF-κB抑制剂Bay 11–7085阻断NF-κB通路,观察对SP和CGRP促炎作用的影响。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 样本保存 | RNAlater | Ambion | AM7021 |
| 免疫组织化学 | SP抗体 | Abcam | ab14184 |
| CGRP抗体 | Abcam | ab36001 | |
| EnVision系统 | Dako | -- | |
| Image-Pro Plus 6.0版 | Media Cybernetics | -- | |
| RT-PCR | PrimeScript RT-PCR试剂盒 | Takara | DRR064A |
| ABI 7500序列检测系统 | Applied Biosystems | -- | |
| ELISA | 人TNF-α ELISA试剂盒 | Xinbo Sheng | EHC103a |
| 人IL-1β ELISA试剂盒 | Xinbo Sheng | EHC002b | |
| 人IL-10 ELISA试剂盒 | Xinbo Sheng | EHC009(H) | |
| SP ELISA试剂盒 | Cayman Chemical | 589101 | |
| CGRP ELISA试剂盒 | Cayman Chemical | 583751 | |
| 细胞消化 | I型胶原酶 | Sigma-Aldrich | -- |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco/Life Technologies | 25300-054 | |
| 细胞培养 | DMEM/F-12培养基 | -- | -- |
| 药物处理 | P物质 | Sigma-Aldrich | S6883 |
| 降钙素基因相关肽 | Sigma-Aldrich | C0167 | |
| Western blot | p65抗体 | Cell Signaling Technology | 4767 |
| 辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| β-actin抗体 | Cell Signaling Technology | 4967 | |
| 增强化学发光试剂盒 | EMD Millipore | -- | |
| NF-κB活化实验 | TransAM NF-κB p65检测试剂盒 | Active Motif | -- |
| L-703606 | Sigma-Aldrich | -- | |
| MK-3207 | Selleck Chemicals | -- | |
| NF-κB抑制实验 | Bay 11-7085 | Sigma-Aldrich | -- |
| 统计分析 | SPSS | SPSS | -- |
| GraphPad Prism 5.01版 | GraphPad Software | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本采集与分组 | DDH严重程度分组标准(Crowe分级和K-L分级),各组样本量,对照组纳入标准 阅读提示:Methods: Patients and materials; Table 1 |
| 滑膜和滑液神经肽和炎症因子检测 | IHC染色切片数量、视野数、样本量;RT-PCR上样量、内参基因;ELISA试剂盒和稀释比例 阅读提示:Methods: Detection and analysis of substance P and CGRP; Gene expression detection; Enzyme-linked immunosorbent assay; Figure 1 legend |
| 滑膜细胞体外培养和处理 | 细胞分离方法、培养条件、细胞代数、处理浓度(SP 100 nM,CGRP 1 nM)、处理时间(24/48小时) 阅读提示:Methods: Incubation of human fibroblast-like synoviocytes; Gene expression of inflammatory cytokines |
| NF-κB通路验证 | Western blot样品量、抗体浓度、NF-κB DNA结合实验方法、抑制剂浓度(Bay 11-7085 30 μM,L-703606 10 μM,MK-3207 1 μM) 阅读提示:Methods: Western blot analysis; NF-κB activation assay; Enzyme-linked immunosorbent assay for role of NF-κB |