RIPK3 promotes hantaviral replication by restricting JAK-STAT signaling without triggering necroptosis.
包含体外细胞模型（BMDMs、HEK293T等）和体内小鼠模型（RIPK3−/−小鼠）的独立证据，并通过RNA-seq、Western blot、co-IP、双荧光素酶等实验进行了功能验证和机制验证。
BMDMs（小鼠骨髓来源巨噬细胞） HEK293T细胞 Huh-7细胞 RIPK3−/− C57BL/6J小鼠
HTNV感染剂量（MOI=1）及感染时间（0-48 h） RIPK3敲低或敲除对ISGs表达和病毒复制的影响 RIPK3与STAT1的相互作用及其对STAT1磷酸化的抑制 RIPK3蛋白激酶结构域缺失（ΔPKD）但不影响激酶活性的突变体对STAT1的影响 体内实验中HTNV感染剂量（5 × 10^5 PFU）和感染天数（9 dpi）
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
探究HTNV感染是否激活坏死性凋亡相关基因并触发细胞死亡。
通过RNA-seq和KEGG通路富集分析HTNV感染的HUVECs和JEV感染的Neuro-2a细胞中细胞死亡相关通路；用qRT-PCR和免疫印迹检测BMDMs中坏死性凋亡相关基因表达；通过ATP检测和Annexin V-PI染色评估细胞活力；用TSZ处理L929细胞诱导坏死性凋亡，检测HTNV对TSZ诱导的MLKL激活、ATP水平和细胞形态的影响。
评估RIPK3是否调节HTNV复制。
通过siRNA敲低ZBP1、RIPK3和MLKL，检测HTNV NP蛋白和S基因表达；使用RIPK3−/− BMDMs和RIPK3过表达细胞，检测病毒复制水平。
探究RIPK3敲除如何影响宿主免疫相关基因表达。
提取WT和RIPK3−/− BMDMs的RNA进行RNA-seq，分析差异表达基因，并进行KEGG通路富集和热图展示炎症细胞因子和干扰素相关基因的表达变化。
验证RIPK3是否通过抑制STAT1磷酸化来限制ISGs表达。
通过免疫印迹检测STAT1和p-STAT1水平；利用双荧光素酶报告基因分析RIPK3对IFN、STAT1和ISRE启动子活性的影响；qRT-PCR检测ISGs表达水平。
确定RIPK3是否与STAT1直接结合以及关键结构域。
通过免疫荧光检测亚细胞定位；通过共转染和外源/内源co-IP验证相互作用；构建RIPK3截短突变体（ΔPKD、ΔRHIM）和激酶失活突变体（K51A、D161N），通过co-IP和免疫印迹检测对STAT1结合及磷酸化的影响。
评估RIPK3缺失是否影响小鼠对HTNV的清除和免疫应答。
WT和RIPK3−/−小鼠经静脉注射HTNV，监测临床症状、体重、体温，并在9 dpi采集血液和组织样本；通过qRT-PCR检测病毒载量；免疫印迹检测NP表达；H&E染色和TEM观察病理变化；免疫荧光检测巨噬细胞浸润和STAT1表达。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco, USA | -- |
| RPMI培养基1640 | Gibco, USA | -- | |
| 胎牛血清 | HyClone | -- | |
| 青霉素-链霉素-庆大霉素溶液（100×） | -- | -- | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液 | -- | -- | |
| 转染 | Hieff trans™脂质体转染试剂 | Yeasen, China | -- |
| Entranster™-R4000 | Engreen, China | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| 反转录 | Hifair® II第一链cDNA合成SuperMix | Yeasen | 11120ES60 |
| 实时荧光定量PCR | Hieff® qPCR SYBR Green预混液 | Yeasen | 11201ES08 |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解缓冲液 | Beyotime, China | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Targetmoi, USA | -- | |
| 磷酸酶抑制剂混合物I和II | Targetmoi, USA | -- | |
| Pierce™ BCA蛋白检测试剂盒 | Thermo, USA | -- | |
| Odyssey红外成像系统 | LI-COR Biosciences, USA | -- | |
| 免疫共沉淀 | 蛋白A/G磁珠 | -- | -- |
| 双荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega, USA | -- |
| 流式细胞术 | Annexin V-PI染色试剂盒 | BD, USA | -- |
| FACSCanto II流式细胞仪 | BD, USA | -- | |
| ATP检测 | ATP检测试剂盒 | Beyotime, China | -- |
| 细胞活力检测 | Calcein/PI细胞活力/细胞毒性检测试剂盒 | Beyotime, China | -- |
| ELISA | QuantiCyto®小鼠IFN-α/β ELISA试剂盒 | -- | -- |
| 免疫荧光 | DAPI染色液 | Sangon Biotech, China | -- |
| Triton X-100 | Sangon Biotech, China | -- | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| 显微镜 | 激光扫描共聚焦显微镜（FV3000） | Olympus, Japan | -- |
| 透射电镜 | 日立HT7700透射电子显微镜 | Hitachi, Japan | -- |
| 蛋白质印迹 | ImageJ软件 | NIH, USA | -- |
| 数据分析 | GraphPad Prism 9软件 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与感染 | 细胞系来源（ATCC）、培养基（DMEM/RPMI 1640）及血清浓度（10%或20% FBS）、HTNV感染MOI=1及感染时间（0-48 h） 阅读提示：Materials and methods: Cell culture, Viral infection |
| 基因敲低/过表达 | siRNA序列（Supplementary Table S2）、转染试剂（Hieff trans™, Entranster™-R4000）、质粒（Supplementary Table S1）、转染时间 阅读提示：Materials and methods: Plasmids and siRNA transfection |
| 信号通路检测 | 抗体信息（Supplementary Table S4）、蛋白裂解液（RIPA）、蛋白酶/磷酸酶抑制剂、SDS-PAGE浓度、免疫印迹及co-IP条件 阅读提示：Materials and methods: Immunoblot assays and coimmunoprecipitation |
| 体内实验 | 小鼠品系（C57BL/6J）、RIPK3−/−小鼠来源、感染剂量（5×10^5 PFU）、感染途径（静脉注射）、观察时间（0-9 dpi）及检测指标（MSS、体重、体温、病毒载量、病理） 阅读提示：Materials and methods: Mouse experiments and sample preparation; Results: sections 3.4-3.6 |
| 统计方法 | 统计学检验（Student's t-test或one-way ANOVA）、显著性水平（P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001）、重复次数（至少三次） 阅读提示：Materials and methods: Quantification and statistical analysis |
