体内和体外检测KLK12表达
确定M. bovis感染是否诱导KLK12表达上调。
通过鼻内感染C57BL/6小鼠（200 CFU/只），在感染后3周和12周收取肺和脾脏，用qRT-PCR检测KLK12表达。体外用M. bovis C68004和N株感染BMDMs和RAW264.7细胞，以不同MOI和时间点处理，用qRT-PCR和Western Blot检测KLK12表达。
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激肽释放酶12通过调节自噬和凋亡调控小鼠巨噬细胞对牛分枝杆菌感染的先天抵抗
Kallikrein 12 Regulates Innate Resistance of Murine Macrophages against Mycobacterium bovis Infection by Modulating Autophagy and Apoptosis.
实验完整度
中包含体内小鼠感染模型和体外BMDM/RAW264.7细胞实验，涵盖基因表达、siRNA敲低、自噬、凋亡、细胞因子检测及CFU分析，但缺少体内功能验证和患者样本。
主要模型
C57BL/6小鼠体内感染模型 骨髓来源巨噬细胞（BMDMs） RAW264.7巨噬细胞
重点核对
KLK12敲低效率（siRNA KLK12-mus-402） M. bovis感染剂量（MOI 10）和时间点（6、24 h） 自噬检测（LC3-II、Beclin-1、p62、β-catenin） 凋亡检测（Annexin V/PI染色、BAX、Bcl-2、Cytochrome c、Caspase 3） 细胞因子检测（IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、IL-10、IFN-β）
摘要
牛分枝杆菌（M. bovis）是结核分枝杆菌复合群（Mtb）的成员，引起牛结核病（TB），并对人类健康构成高度人畜共患威胁。激肽释放酶（KLKs）属于分泌型丝氨酸蛋白酶亚群。由于它们在各种生理和病理过程中的作用已被确定，KLKs的表达可能介导宿主对牛分枝杆菌感染的免疫反应。在本研究中，我们报道了在牛分枝杆菌感染中，体内和体外KLK12表达上调。为了明确KLK12在小鼠巨噬细胞免疫反应调节中的作用，我们通过siRNA转染制备了KLK12敲低的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）。有趣的是，KLK12的敲低导致牛分枝杆菌感染的BMDMs中自噬和凋亡显著下调。此外，我们证明KLK12介导的自噬和凋亡调节分别涉及mTOR/AMPK/TSC2和BAX/Bcl-2/Cytochrome c/Caspase 3通路。同样，炎症细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α在KLK12敲低巨噬细胞中显著下调，但IL-10和IFN-β的表达差异不显著。综上所述，这些发现表明，在牛分枝杆菌感染的小鼠巨噬细胞中，KLK12的上调通过调节自噬、凋亡和促炎通路，在保护性免疫反应调节中发挥重要作用。据我们所知，这是关于KLK12在牛分枝杆菌感染中表达和作用的首次报道，这些数据可能为牛结核病的诊断和治疗提供新的范式。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- KLK12在牛分枝杆菌感染的小鼠巨噬细胞中表达是否上调，以及其在调节先天免疫反应（自噬、凋亡和细胞因子表达）中的作用是什么？
- 核心机制
- KLK12通过调节mTOR/AMPK/TSC2通路介导自噬，通过调节BAX/Bcl-2/Cytochrome c/Caspase 3通路介导凋亡，并促进促炎细胞因子表达。
- 主要证据
- 在M. bovis感染的BMDMs中，siRNA敲低KLK12显著下调自噬和凋亡，并降低IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α表达，同时增加细胞内M. bovis存活。
- 研究意义
- 首次报道KLK12在M. bovis感染中的表达和作用，可能为牛结核病的诊断和宿主导向治疗提供新思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证M. bovis感染诱导自噬
确认M. bovis感染是否上调自噬标志物。
用M. bovis C68004感染BMDMs，以不同MOI和时间点处理，通过Western Blot检测LC3-II、Beclin-1和β-catenin表达。
敲低KLK12观察对自噬的影响
确定KLK12敲低是否影响M. bovis诱导的自噬。
使用siRNA转染BMDMs敲低KLK12，48小时后感染M. bovis（MOI 10），在6和24小时检测自噬标志物。并用雷帕霉素和巴弗洛霉素A1处理，检测LC3-II水平。
验证KLK12介导自噬的信号通路
探讨KLK12调节自噬是否通过AMPK/TSC2/mTOR通路。
在KLK12敲低和对照BMDMs感染M. bovis后，通过Western Blot检测磷酸化AMPK、TSC2和mTOR水平。
检测KLK12对凋亡的调控
确定KLK12敲低是否影响M. bovis诱导的凋亡。
通过流式细胞术（Annexin V/PI染色）和Western Blot检测凋亡相关蛋白（BAX、Bcl-2、Cytochrome c、Caspase 3）在KLK12敲低和对照BMDMs中的变化。
检测KLK12对细胞因子表达的影响
确定KLK12敲低是否改变炎症细胞因子表达。
通过qRT-PCR和ELISA检测KLK12敲低和对照BMDMs感染M. bovis后细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、IL-10、IFN-β）的表达。
评估KLK12对细胞内M. bovis存活的影响
确定KLK12是否影响巨噬细胞控制M. bovis感染的能力。
在KLK12敲低和对照BMDMs感染M. bovis后，通过CFU测定评估细菌存活。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Hyclone | -- |
| RPMI1640培养基 | Hyclone | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | Peprotech | -- | |
| 7H9 Middlebrook培养基 | Difco | -- | |
| 细菌培养 | OADC富集液 | BD Biosciences | -- |
| 分枝杆菌生长素J | Dickinson and Sparks Company | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| Western blot | 抗KLK12抗体 | BioVision | 3720-100 |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Proteintech | 11224-1-AP | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 20536-1-AP | |
| 抗LC3抗体 | Proteintech | 18725-1-AP | |
| 抗Beclin 1抗体 | Proteintech | 11306-1-AP | |
| 抗P62抗体 | Proteintech | 18420-1-AP | |
| 抗β-连环蛋白抗体 | Proteintech | 51067-2-AP | |
| 抗BAX抗体 | Proteintech | 50599-2-Ig | |
| 抗细胞色素C抗体 | Proteintech | 10993-1-AP | |
| 抗TOM20抗体 | Proteintech | 11802-1-AP | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体 | Proteintech | SA00001-2 | |
| 磷酸化AMPKα抗体 | Cell Signaling Technology | 877-616-CELL | |
| 磷酸化mTOR抗体 | Cell Signaling Technology | S2481 | |
| 磷酸化结节性硬化复合物2抗体 | Cell Signaling Technology | 877-678-CELL | |
| Caspase 3抗体 | Abcam | GR64557-1 | |
| Bcl-2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | F0106 | |
| 山羊抗小鼠二抗 | Beijing ZSGB Biotechnology | ZB-5305 | |
| ELISA | 小鼠IL-1β ELISA试剂盒 | Neobioscience Technology | -- |
| 小鼠IL-10 ELISA试剂盒 | Neobioscience Technology | -- | |
| 小鼠IL-12 ELISA试剂盒 | Neobioscience Technology | -- | |
| 小鼠IFN-β ELISA试剂盒 | Neobioscience Technology | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiter 96Aqueous one solution细胞增殖检测试剂盒 | Promega | -- |
| 药物处理 | 雷帕霉素（西罗莫司） | Selleckchem | S1039 |
| 巴弗洛霉素A1 | Solarbio Life Sciences | A8510 | |
| RNA提取 | RNA提取试剂盒 | Aidlab Biotechnology | -- |
| cDNA合成 | RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| qRT-PCR | AceQ qPCR SYBR Green预混液 | Vazyme Biotech | -- |
| ViiA7实时荧光定量PCR系统 | ABI | -- | |
| 线粒体分离 | 细胞线粒体分离试剂盒 | Beyotime | -- |
| 流式细胞术 | Annexin V/碘化丙啶染色试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- |
| BD FACS Calibur流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解液 | Sigma Aldrich | -- |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | -- | |
| 增强化学发光底物 | Bio-Rad | -- | |
| BIO-RAD成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞裂解 | Triton X-100 | -- | -- |
| 细菌培养 | 7H10琼脂平板 | -- | -- |
| 蛋白质印迹 | SDS上样缓冲液 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物感染 | 小鼠品系、年龄、性别、分组、感染剂量、感染途径、安乐死时间点 阅读提示：见2.4节和Figure 1A,B |
| 细胞感染 | 细胞类型、MOI、感染时间点、感染后培养条件 阅读提示：见2.5节和2.6节 |
| siRNA转染 | siRNA序列、浓度、转染试剂、转染时间、敲低效率验证 阅读提示：见2.6节和Supplementary Table S1 |
| 自噬检测 | 自噬标志物、检测方法、雷帕霉素和巴弗洛霉素A1的浓度和处理时间 阅读提示：见3.3节和Figure 3 |
| 凋亡检测 | 凋亡检测方法、时间点、线粒体和胞质分离方法 阅读提示：见2.8节和3.5节 |
| 细胞因子检测 | 检测方法（qRT-PCR、ELISA）、引物序列、ELISA试剂盒 阅读提示：见2.7节、2.11节和3.6节 |
| 细菌存活 | CFU测定方法、裂解条件、涂板培养基、培养时间 阅读提示：见2.12节和3.7节 |