体外LIPUS参数筛选
筛选LIPUS的安全和有效参数（强度、占空比）
使用MTECs，检测不同LIPUS强度（25、102、315、410 mW/cm²）和占空比（1%、10%）对细胞凋亡和TGF-β1诱导的α-SMA表达的影响，并检测对足细胞的安全性和podocin表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
低强度脉冲超声通过抑制肾小管IL-1R治疗肾纤维化
Low-intensity pulsed ultrasound stimulation to treat renal fibrosis through inhibiting tubular IL-1R.
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内动物模型、条件性基因敲除小鼠及转录组测序，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
小鼠肾小管上皮细胞（MTECs） 人足细胞系 单侧肾缺血再灌注（IR）诱导的CKD小鼠模型 肾近端小管特异性Il1r1敲除小鼠（Pepck-Cre+ Il1r1fl/fl）
重点核对
LIPUS参数：强度315 mW/cm²，1%占空比，1 MHz，每日每肾20分钟 小鼠模型：雄性C57BL/6小鼠（8周龄），单侧IR（35分钟缺血） IL-1β刺激：重组小鼠IL-1β（10 ng/g）术中注射 对照组：假手术组（同麻醉），Pepck-Cre- Il1r1fl/fl同窝对照 检测终点：血清肌酐（Cr）、肾小管损伤评分、纤维化评分、蛋白和mRNA表达
摘要
低强度脉冲超声刺激（LIPUS）因其对肾脏疾病的治疗作用而日益受到重视。然而，其在治疗慢性肾脏病中的作用和生物学机制仍不清楚。在此，我们揭示LIPUS在25–315 mW/cm2的强度范围内是安全的。每天以315 mW/cm2强度的LIPUS改善了缺血/再灌注（IR）诱导的肾小管损伤和肾纤维化，并伴有IL-1R的显著下调。转录组测序显示，在IL-1β刺激的IR损伤小鼠中，LIPUS显著下调了IL-1R及其下游基因。LIPUS通过下调IL-1R，在体内和体外有效逆转了IL-1β诱导的肾小管损伤，并减少了促纤维化细胞因子的产生。肾近端小管特异性Il1r1基因敲除小鼠在IR损伤后表现出较轻的肾小管损伤和纤维化。然而，LIPUS并未改善近端小管特异性Il1r1基因敲除小鼠的IR损伤。总之，每天以315 mW/cm2强度的LIPUS可缓解IR诱导的肾小管损伤和纤维化，可能通过下调肾小管IL-1R实现。LIPUS通过下调肾小管IL-1R缓解IR诱导的肾小管损伤和纤维化，每天以315 mW/cm2强度的LIPUS可能是治疗CKD的一种有前景的方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- LIPUS是否以及如何通过调节IL-1R信号通路缓解肾缺血再灌注诱导的肾小管损伤和纤维化？
- 核心机制
- LIPUS通过下调肾小管上皮细胞中的IL-1R，抑制其下游MyD88/NF-κB和c-Myc信号通路，从而减轻肾小管损伤和纤维化。
- 主要证据
- 在IR诱导的CKD小鼠中，LIPUS显著下调IL-1R及其下游蛋白（MyD88、p-NF-κB、c-Myc），并改善肾功能和纤维化；体外实验中，LIPUS逆转了IL-1β诱导的MTECs中α-SMA和纤连蛋白的上调；肾近端小管特异性Il1r1敲除小鼠中，LIPUS未额外改善损伤，表明IL-1R是关键介质。
- 研究意义
- 确定了LIPUS治疗CKD的优选参数（315 mW/cm²，1%占空比），为LIPUS治疗CKD的临床应用提供了参考。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内LIPUS治疗IR诱导的CKD小鼠
评估LIPUS对IR诱导的CKD小鼠的肾保护作用
通过单侧肾IR手术建立CKD模型，术后次日开始LIPUS治疗（每日或隔日，持续14天），检测血清肌酐、肾小管损伤评分、纤维化评分，并通过PAS和Masson染色评估组织学，检测纤维化标志物、炎症标志物和IL-1β水平。
LIPUS对IL-1β/IL-1R信号通路的影响
验证LIPUS是否通过下调IL-1R及其下游信号通路发挥保护作用
在体内检测肾组织IL-1R、MyD88、p-NF-κB、c-Myc蛋白水平；在体外用IL-1β刺激MTECs，检测α-SMA、纤连蛋白、IL-1R、p-NF-κB、c-Myc表达，并进行RNA-seq分析差异表达基因和通路富集。
IL-1β刺激的IR损伤小鼠模型
验证LIPUS通过下调IL-1R在IL-1β刺激的IR损伤中发挥保护作用
在IR手术时给予重组IL-1β（10 ng/g），术后LIPUS治疗14天，检测血清Cr、肾小管损伤、纤维化评分以及纤维化、炎症和IL-1R通路标志物。
肾近端小管特异性Il1r1敲除小鼠验证
证明LIPUS的保护作用依赖于肾小管IL-1R
使用Pepck-Cre+ Il1r1fl/fl小鼠（KO）进行IR损伤，比较LIPUS治疗与未治疗组，检测血清Cr、肾损伤评分、纤维化标志物和下游信号分子。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 低强度脉冲超声换能器 | Nanjing KHONS Medtech Co., Ltd. | KYI-F-16-01000 |
| 细胞实验 | 低强度脉冲超声换能器 | Nanjing KHONS Medtech Co., Ltd. | KYI-F-34-01000 |
| 细胞培养 | 小鼠肾小管上皮细胞 | ATCC | CCL-139 |
| 重组人转化生长因子β1 | Peprotech | AF-100-21C | |
| 重组小鼠白细胞介素-1β | R&D Systems | 401-ML | |
| 流式分析 | Annexin V-FITC和碘化丙啶 | BD Biosciences | 556547 |
| 细胞培养 | 标准聚苯乙烯培养板 | NEST | 706001 |
| RT-qPCR | FastPure细胞/组织总RNA提取试剂盒 | Vazyme | RC112 |
| HiScript III一步法逆转录预混液 | Vazyme | R333 | |
| ChamQ SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q321 | |
| Western blot | 抗纤连蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | F3648 |
| 抗α-SMA抗体 | Abcam | ab7817 | |
| 抗IL-1R抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-393998 | |
| 抗磷酸化NF-κB p65 (Ser536)抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| 抗MyD88抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-74532 | |
| 抗c-Myc抗体 | Proteintech | 10828 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Abcam | ab6789 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Abcam | ab6721 | |
| 免疫荧光 | DAPI封片剂 | SouthernBiotech | 0100-20 |
| 免疫组化 | 抗F4/80抗体 | ServiceBio | GB113373 |
| 抗Ly6G抗体 | ServiceBio | GB11229 | |
| DAB底物试剂盒 | MXB Biotechnologies | DAB-0031 | |
| ELISA | 小鼠IL-1β ELISA试剂盒 | Neobioscience Technology | EMC001b |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 5300生物分析仪 | Agilent | -- | |
| NanoDrop2000分光光度计 | NanoDrop Technologies | -- | |
| 动物实验 | 自动生化分析仪 | Rayto Inc. | Chemray-240 |
| 自动血液分析仪 | Mindray | BC-2800vet | |
| 组织学染色 | Leica DM3000显微镜 | Leica Microsystems | DM3000 |
| 免疫组化 | Axioscan 7扫描系统 | ZEISS | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外LIPUS参数筛选 | LIPUS强度（25、102、315、410 mW/cm²）、占空比（1%和10%）、处理时间20分钟、MTECs细胞系（ATCC CCL-139）、TGF-β1浓度15 ng/mL 阅读提示：Methods: LIPUS treating MTECs and podocytes in vitro; Figure 1 |
| 体内LIPUS治疗IR诱导的CKD小鼠 | 小鼠品系、年龄、性别（雄性C57BL/6，8周龄）、IR手术缺血时间35分钟、LIPUS强度315 mW/cm²、占空比1%、频率1 MHz、每日或隔日治疗、每肾20分钟、治疗周期14天、假手术对照 阅读提示：Methods: Experimental protocols; Figure 2 |
| IL-1β刺激的IR损伤模型 | IL-1β给药方式（术中注射）、剂量（10 ng/g）、LIPUS治疗参数（每日，315 mW/cm²，1%占空比）、检测时间点（术后14天） 阅读提示：Methods: Experimental protocols; Figure 5 |
| 肾近端小管特异性Il1r1敲除小鼠验证 | 小鼠基因型（Pepck-Cre+ Il1r1fl/fl和Pepck-Cre- Il1r1fl/fl）、IR手术条件、LIPUS治疗参数（每日，315 mW/cm²）、对照选择 阅读提示：Methods: Animals; Experimental protocols; Figure 8 |
| RNA测序分析 | RNA提取方法（TRIzol）、测序平台（Illumina）、差异表达基因筛选标准（|log2FC|≥0.58，FDR<0.05）、KEGG富集分析阈值（Benjamini-Hochberg调整P<0.05） 阅读提示：Methods: RNA sequencing; Figure 6 |