建立伊马替尼耐药GIST细胞模型并验证其耐药特性
通过逐步递增伊马替尼浓度建立耐药细胞株，并验证其耐药性，以模拟临床获得性耐药。
将GIST-882和GIST-T1细胞暴露于逐渐增加浓度的伊马替尼至少6个月，获得耐药细胞株GIST-882-IR和GIST-T1-IR；通过CCK-8检测IC50确认耐药性。
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β-榄香烯通过靶向N6AMT1促进铁死亡以提高胃肠道间质瘤对伊马替尼的敏感性
β-elemene promotes ferroptosis to improve the sensitivity of imatinib in gastrointestinal stromal tumours by targeting N6AMT1.
实验完整度
高包含体外（细胞活力、克隆形成、铁死亡指标检测）、体内（CDX和PDX模型）以及临床样本IHC和Western blot等多个独立证据层级，并明确功能验证（敲低/过表达N6AMT1、NRF2）和机制验证（CETSA、分子对接、pull-down）。
主要模型
GIST-882细胞系 GIST-T1细胞系 GIST-882-IR和GIST-T1-IR伊马替尼耐药株 细胞系来源异种移植瘤模型（CDX）和患者来源异种移植瘤模型（PDX）
重点核对
GIST-882-IR细胞用30 μM伊马替尼和40 μg/L β-榄香烯联合处理48小时 GIST-T1-IR细胞用20 nM伊马替尼和10 μg/L β-榄香烯联合处理48小时 CDX模型：BALB/c裸鼠皮下注射4×10^6 GIST-T1-IR细胞，伊马替尼口服25 mg/kg，β-榄香烯腹腔注射50 mg/kg，每3天一次 PDX模型：使用临床伊马替尼耐药GIST组织建立，处理方式同CDX 铁死亡抑制剂Fer-1（1 μM）预处理6小时
摘要
背景：伊马替尼已广泛用于胃肠道间质瘤（GIST），并显著改善了GIST患者的预后，但约一半的患者出现获得性治疗耐药，凸显了新型治疗策略的紧迫性。方法：采用多种生物信息学工具和实验室实验、RNA测序、动物模型以及热蛋白质组分析（TPP）实验来验证我们的发现并研究β-榄香烯的抗肿瘤作用。结果：我们发现伊马替尼耐药的GIST与铁死亡活性的负调控相关，诱导铁死亡可以增强耐药细胞对伊马替尼的敏感性。此外，我们发现β-榄香烯通过诱导铁死亡增强伊马替尼耐药GIST细胞对伊马替尼的敏感性。而且，β-榄香烯和伊马替尼的联合治疗在体内外均显示出比单一疗法显著增强的抗肿瘤疗效。机制上，β-榄香烯特异性靶向N6AMT1，抑制其转录抑制功能并激活核因子E2相关因子2（NRF2）-HMOX1信号通路以诱导铁死亡。结论：β-榄香烯可以靶向N6AMT1，通过增加NRF2和HMOX1的表达促进铁死亡。这些发现表明β-榄香烯是提高胃肠道间质瘤对伊马替尼敏感性的一种有前景的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探索β-榄香烯能否通过诱导铁死亡增强伊马替尼耐药GIST细胞对伊马替尼的敏感性，并阐明其分子机制。
- 核心机制
- β-榄香烯直接结合N6AMT1（主要结合位点Asp103），抑制N6AMT1对NRF2启动子的甲基化修饰，从而解除其转录抑制作用，上调NRF2和HMOX1表达，促进脂质过氧化和铁死亡。
- 主要证据
- TPP和pull-down实验证实β-榄香烯与N6AMT1直接结合；siRNA敲低N6AMT1降低NRF2启动子甲基化并上调NRF2/HMOX1表达，过表达则相反；CETSA、分子对接以及细胞、动物模型中的功能验证实验均支持该机制。
- 研究意义
- β-榄香烯作为提高GIST对伊马替尼敏感性的潜在治疗策略，尤其为无二次突变的伊马替尼耐药患者提供了新思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估铁死亡活性与伊马替尼耐药的相关性
检测耐药细胞中铁死亡标志物和代谢物水平，以明确耐药是否与铁死亡抑制相关。
Western blot检测FTH1、GPX4、SLC7A11等铁死亡标志物；检测脂质过氧化（BODIPY C11）、Fe2+（FerroOrange）、MDA和ROS水平；临床样本IHC和Western blot验证。
验证铁死亡诱导剂增强伊马替尼敏感性
通过预处理铁死亡诱导剂erastin和RSL3，观察是否能增加耐药细胞对伊马替尼的敏感性。
用erastin（1 μM）和RSL3（0.5 μM）预处理GIST-882-IR和GIST-T1-IR细胞6小时，再加入伊马替尼，通过CCK-8、克隆形成和PI染色检测细胞活力和死亡。
验证β-榄香烯联合伊马替尼诱导铁死亡
检测联合用药处理后铁死亡特征性指标（ROS、Fe2+、脂质过氧化、MDA）和线粒体超微结构变化。
将GIST-882-IR和GIST-T1-IR细胞用DMSO、伊马替尼、β-榄香烯或联合处理24小时，检测细胞内Fe2+（FerroOrange）、MDA、脂质过氧化（BODIPY C11）、ROS（DCFH-DA），并用透射电镜观察线粒体形态。
评估β-榄香烯与伊马替尼的协同作用及铁死亡依赖性
通过CI值、克隆形成和细胞死亡检测确定两药协同效应，并验证其是否依赖铁死亡。
用不同浓度组合处理细胞48小时，计算CI值；进行克隆形成和PI染色；用Fer-1抑制铁死亡后观察联合治疗效果是否被逆转。
明确HMOX1在β-榄香烯诱导铁死亡中的作用
验证HMOX1是否为β-榄香烯诱导铁死亡的关键效应分子，并探索其调控机制。
通过RNA-seq发现HMOX1在联合处理中上调；Western blot验证；构建HMOX1过表达细胞，检测对伊马替尼敏感性的影响；使用Hemin和ZnPP分别激活和抑制HMOX1，观察对铁死亡的影响；体内CDX模型验证。
鉴定β-榄香烯的直接靶点N6AMT1并验证结合方式
通过TPP、CETSA、分子对接和pull-down实验确定β-榄香烯的靶蛋白及结合位点。
利用TPP筛选差异蛋白，结合CETSA验证β-榄香烯与N6AMT1的结合；分子对接预测结合位点（Asp103、Lys2、Asn77）；合成β-榄香烯-生物素探针进行pull-down；通过突变实验验证关键结合位点。
验证N6AMT1调控NRF2/HMOX1轴的机制
证明β-榄香烯通过抑制N6AMT1功能，调节NRF2启动子甲基化从而影响NRF2和HMOX1表达。
在GIST细胞中敲低或过表达N6AMT1，检测NRF2和HMOX1表达；用qMSP检测NRF2启动子甲基化水平；敲低NRF2后验证HMOX1表达和铁死亡水平。
体内动物模型验证联合治疗效果
在CDX和PDX模型中验证β-榄香烯联合伊马替尼的抗肿瘤效果，并检测铁死亡相关标志物。
建立GIST-T1-IR细胞系来源异种移植瘤模型（CDX）和患者来源异种移植瘤模型（PDX），用伊马替尼和β-榄香烯单药或联合处理，测量肿瘤体积和重量，并通过IHC检测Ki67、NRF2、HMOX1和4-HNE表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 庆大霉素 | -- | -- | |
| 药物处理 | β-榄香烯 | Dalian HolleyKingkong Pharmaceutical Co. Ltd. | -- |
| 伊马替尼 | TargetMol | T6230 | |
| Erastin | MedChemExpress | HY-15763 | |
| RSL3 | MedChemExpress | HY-100218 | |
| Ferrostatin-1 | MedChemExpress | HY-100579 | |
| 氯化血红素 | Sigma-Aldrich | 51280 | |
| 锌原卟啉-9 | Meilunbio | MB4231 | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Dojindo | LJ621 |
| 细胞死亡检测 | 碘化丙啶 | SIGMA | 537059 |
| Western blot | NP-40 | Beyotime | P0013F |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma-Aldrich | 302-954 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PVDF膜 | Bio-Rad | -- | |
| 增强化学发光试剂盒 | Thermo Scientific | -- | |
| 抗caspase-3抗体 | Proteintech | 19677-1-AP | |
| 抗cleaved caspase-3抗体 | CST | 9664S | |
| 抗caspase-7抗体 | Proteintech | 27155-1-AP | |
| 抗cleaved caspase-7抗体 | CST | 9491T | |
| 抗GSDMD抗体 | Proteintech | 20770-1-AP | |
| 抗GSDME抗体 | Proteintech | 13075-1-AP | |
| 抗GPX4抗体 | Affinity Biosciences | DF6701 | |
| 抗FTH1抗体 | Affinity Biosciences | DF4828 | |
| 抗ACSL3抗体 | Affinity Biosciences | DF9606 | |
| 抗vinculin抗体 | CST | 13901S | |
| 抗HMOX1抗体 | Proteintech | 10701-1-AP | |
| 抗NRF2抗体 | Proteintech | 16396-1-AP | |
| 抗N6AMT1抗体 | Proteintech | 16211-1-AP | |
| 抗SLC7A11抗体 | Proteintech | 26864-1-AP | |
| 抗FSP1抗体 | Proteintech | 20886-1-AP | |
| 抗DHODH抗体 | Proteintech | 14877-1-AP | |
| 抗SMYD2抗体 | Proteintech | 21290-1-AP | |
| IHC | 抗Ki67抗体 | Abcam | ab15580 |
| 抗4-羟基壬烯醛抗体 | R&D | MAB3249 | |
| Fe2+检测 | FerroOrange探针 | Dojindo | -- |
| MDA检测 | MDA检测试剂盒 | Dojindo | -- |
| ROS检测 | DCFH-DA检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 脂质过氧化检测 | BODIPY 581/591 C11探针 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| TEM | 醋酸铀酰 | -- | -- |
| Spurr包埋试剂盒 | KYD bio | 14300 | |
| 电子显微镜 | HITACHI | -- | |
| 细胞转染 | 靶向N6AMT1和SMYD2的siRNA | GENE CREATE | -- |
| jetPRIME转染试剂 | Polyplus | 101000046 | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| PrimeScript RT试剂盒 | TaKaRa Bio | RR037A | |
| LightCycler 480实时荧光定量PCR仪 | Roche Diagnostics | -- | |
| RNA-seq | Illumina HiSeq测序平台 | Illumina | -- |
| TPP | 液相色谱-质谱联用 | -- | -- |
| 分子对接 | PyMol 2.5.4 | -- | -- |
| AutoDock 1.5.7 | -- | -- | |
| pull-down实验 | 链霉亲和素磁珠 | -- | -- |
| qMSP | EZ DNA甲基化-Lightning自动化试剂盒 | Zymo Research | -- |
| QuantiTect 2× SYBR Green PCR预混液 | Invitrogen | -- | |
| 生物信息学分析 | R软件 | -- | -- |
| GraphPad Prism 9 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养及耐药株建立 | 细胞系来源：GIST-882（ATCC）和GIST-T1（中山大学肿瘤防治中心馈赠）；培养条件：RPMI1640+15% FBS+1%青霉素/链霉素+1% L-谷氨酰胺+2 µg/mL庆大霉素；耐药诱导：伊马替尼浓度梯度递增，持续至少6个月；功能实验前停药至少1周。 阅读提示：参见Materials and Methods第2.1节 |
| 药物处理与联合用药 | GIST-882-IR：伊马替尼30 µM，β-榄香烯40 µg/L；GIST-T1-IR：伊马替尼20 nM，β-榄香烯10 µg/L；处理时间48小时（用于CI和细胞死亡检测）。 阅读提示：参见Results第3.4节及图4 |
| 体外铁死亡诱导与抑制 | Erastin浓度1 µM，RSL3浓度0.5 µM，预处理6小时；Fer-1浓度未明确说明；处理时间24小时用于Fe2+、MDA、脂质过氧化和ROS检测。 阅读提示：参见Results第3.2节和第3.3节 |
| Western blot | 一抗信息：anti-GPX4（Affinity DF6701）、anti-FTH1（Affinity DF4828）、anti-HMOX1（Proteintech 10701-1-AP）等；蛋白上样量未明确说明。 阅读提示：参见Materials and Methods第2.5节及表S1 |
| 体内动物实验 | CDX模型：5-6周龄雌性BALB/c裸鼠，皮下注射4×10^6 GIST-T1-IR细胞；给药方案：伊马替尼口服25 mg/kg，β-榄香烯腹腔注射50 mg/kg，每3天一次；PDX模型：使用临床伊马替尼耐药GIST组织，传代至F1代。 阅读提示：参见Materials and Methods第2.22节 |