筛选SARS-CoV-2非结构蛋白对ISRE活性的影响
鉴定抑制I型干扰素信号的病毒蛋白
在HEK293T细胞中共转染17个SARS-CoV-2基因表达质粒和ISRE-luc报告质粒，并用poly(I:C)刺激，检测ISRE-luc活性。
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SARS-CoV-2 Nsp8 通过损害 TRIM4 介导的 K63 连接的多聚泛素化抑制 MDA5 抗病毒免疫应答
SARS-CoV-2 Nsp8 suppresses MDA5 antiviral immune responses by impairing TRIM4-mediated K63-linked polyubiquitination.
实验完整度
高包含细胞系水平功能验证、RNA病毒感染实验、SARS-CoV-2感染实验、免疫共沉淀、体外泛素化、计算机结构预测等多层级实验，明确验证机制通路。
主要模型
HEK293T细胞 A549细胞 SARS-CoV-2感染或复制子模型 EMCV和VSV感染模型
重点核对
nsp8抑制MDA5而非RIG-I介导的ISRE活性 nsp8与MDA5 CARDs结构域相互作用 nsp8抑制TRIM4介导的MDA5 K63多聚泛素化 MDA5 K43和K174是TRIM4介导的K63泛素化位点 nsp7/nsp8/nsp12复合物竞争性抑制nsp8的免疫抑制功能
摘要
黑色素瘤分化相关基因5（MDA5）作为细胞质 RNA 传感器，检测病毒双链 RNA，并介导针对 RNA 病毒感染的抗病毒先天免疫应答。识别病毒双链 RNA 后，MDA5 通过 K63 连接的多聚泛素化被激活，然后触发 MAVS 的招募以及 TBK1 和 IKKα/β 的激活，随后导致 IRF3 和 NF-κB 磷酸化。然而，MDA5 K63 多聚泛素化的特异性 E3 泛素连接酶尚未得到很好的表征。大量有症状和重症的 SARS-CoV-2 感染正在全球蔓延，I 型干扰素和抗病毒免疫药物治疗效果不佳表明 SARS-CoV-2 通过若干未知机制逃避抗病毒免疫应答。在此，我们报道 SARS-CoV-2 非结构蛋白 8（nsp8）作为抗病毒先天免疫和炎症反应的抑制因子，促进 SARS-CoV-2 的感染。它通过结合 MDA5 和 TRIM4 并损害 TRIM4 介导的 MDA5 K63 连接的多聚泛素化，下调 I 型干扰素、干扰素刺激基因和促炎细胞因子的表达。我们的发现揭示了 nsp8 在 SARS-CoV-2 感染期间介导先天免疫逃逸，并可能作为未来 SARS-CoV-2 传染病治疗学的潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SARS-CoV-2 nsp8蛋白是否以及如何抑制MDA5介导的抗病毒先天免疫应答？
- 核心机制
- nsp8与MDA5 CARDs结构域和TRIM4相互作用，损害TRIM4介导的MDA5 K43和K174位点的K63连接多聚泛素化，从而抑制MDA5信号体激活和下游IRF3/NF-κB通路。
- 主要证据
- 通过过表达和敲低实验、免疫共沉淀、体外泛素化实验以及SARS-CoV-2感染模型，证明nsp8抑制MDA5 K63多聚泛素化并减弱抗病毒细胞因子表达，且依赖MDA5而非RIG-I。
- 研究意义
- 研究揭示了SARS-CoV-2 nsp8介导的先天免疫逃逸机制，为COVID-19治疗提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证nsp8对RNA病毒诱导的免疫基因表达的影响
确认nsp8抑制抗病毒免疫应答
在HEK293T细胞中过表达nsp8，感染SARS-CoV-2或EMCV或VSV，或用poly(I:C)刺激，检测TNF、IFNB、IFIT1等表达。
确定nsp8作用的信号通路靶点
检测nsp8是否特异性抑制MDA5介导的信号
在HEK293T细胞中过表达MDA5、RIG-I、MAVS、TBK1、IRF3等，检测ISRE和NF-κB活性，并通过敲低MDA5或RIG-I验证nsp8的依赖性。
验证nsp8与MDA5和TRIM4的相互作用
检测nsp8是否直接结合MDA5和TRIM4
通过免疫共沉淀和pull-down实验检测nsp8与MDA5、TRIM4的结合，并确定结合结构域。
检测nsp8对MDA5多聚泛素化的影响
验证nsp8是否抑制TRIM4介导的MDA5 K63多聚泛素化
体内泛素化实验检测过表达nsp8或敲低TRIM4时MDA5的K63和K48泛素化水平；体外泛素化实验使用纯化的MDA5 CARDs和TRIM4。
鉴定MDA5 K63泛素化位点
确定TRIM4介导的MDA5泛素化关键赖氨酸残基
将MDA5 CARDs结构域中的赖氨酸突变，检测K63泛素化及ISRE活性。
评估nsp8对SARS-CoV-2感染的影响
验证nsp8促进SARS-CoV-2感染和复制
在A549细胞中过表达nsp8并感染SARS-CoV-2，检测病毒N和S基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | KeyGEN BioTECH | -- |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | VivaCell | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 细胞转染 | 脂质体2000 | Invitrogen | -- |
| PEI Max转染试剂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 实时荧光定量PCR | StarScript III一步法逆转录混合液 | GenStar | A230-10 |
| 2×RealStar绿色快速混合液 | GenStar | A301-10 | |
| 荧光素酶报告实验 | 双荧光素酶检测试剂盒 | Promega | -- |
| Synergy2读板机 | Bio-Tek | -- | |
| 免疫印迹 | PVDF膜 | Millipore | -- |
| Odyssey Sa成像系统 | LI-COR | -- | |
| 免疫共沉淀 | 抗GFP琼脂糖珠 | AlpaLife | -- |
| 抗Flag琼脂糖珠 | AlpaLife | -- | |
| 抗HA琼脂糖珠 | AlpaLife | -- | |
| 抗GST琼脂糖珠 | Cytiva | -- | |
| pull-down实验 | 谷胱甘肽琼脂糖珠 | Cytiva | -- |
| 镍螯合琼脂糖珠 | Cytiva | -- | |
| 免疫荧光 | DAPI染色液 | Sigma-Aldrich | D9542 |
| Alexa Fluor 488标记的抗兔IgG | Invitrogen | A11034 | |
| Alexa Fluor 555标记的抗兔IgG | Invitrogen | A27039 | |
| Zeiss LSM800共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| ELISA | IFNβ ELISA试剂盒 | NeoBioscience | EHC026b |
| TNFα ELISA试剂盒 | NeoBioscience | EHC103a | |
| 药物处理 | MG132 | -- | -- |
| 刺激物 | 聚肌苷酸-聚胞苷酸 | Sigma-Aldrich | P9852 |
| 聚脱氧腺苷酸-聚脱氧胸苷酸 | Invivogen | tlrl-patn-1 | |
| 蛋白质纯化 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与转染 | 细胞系（HEK293T、A549等）的来源和培养条件；转染试剂及用量；质粒浓度 阅读提示：参见 Materials and methods 中 'Cell cultures, antibodies and reagents' 和 'Transfection and luciferase reporter assays' |
| 病毒感染 | 病毒种类和感染复数（MOI）；感染时间；SARS-CoV-2感染条件及生物安全等级 阅读提示：参见 Materials and methods 中 'Virus infection and viral RNA extraction' 和相应图注 |
| 基因表达检测 | RT-PCR引物序列和反应条件；内参基因；分析基因列表 阅读提示：参见 Materials and methods 中 'Real-time PCR' |
| 蛋白相互作用与泛素化 | 抗体和珠子种类；裂解液成分；免疫沉淀和洗脱步骤；MG132浓度和孵育时间；体外泛素化反应条件 阅读提示：参见 Materials and methods 中 'Immunoprecipitation and immunoblot analysis', 'Pull down assays', 'In vitro and in vivo ubiquitination' |