体外药物筛选与协同效应验证
验证WEE1抑制剂（AZD1775）能否激活ATR通路，以及联合ATR抑制剂（AZD6738）是否产生协同抗肿瘤效应
用不同浓度和时间处理卵巢癌细胞系，Western blot检测p-ATR水平；用CCK-8、克隆形成和流式凋亡检测联合治疗对14种癌细胞系的影响。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
WEE1抑制剂与共济失调毛细血管扩张突变和Rad3相关抑制剂触发干扰素基因刺激因子依赖性免疫反应，并通过程序性死亡配体1阻断增强肿瘤治疗效果
WEE1 inhibitor and ataxia telangiectasia and RAD3-related inhibitor trigger stimulator of interferon gene-dependent immune response and enhance tumor treatment efficacy through programmed death-ligand 1 blockade.
实验完整度
高包含体外细胞系实验（增殖、凋亡、Western blot、免疫荧光）、体内同源小鼠模型（卵巢癌和结直肠癌）以及功能验证（siRNA敲低STING、抗PD-L1、抗CD8）多个独立证据层级。
主要模型
人卵巢癌细胞系（OVCAR8，ID8等） 小鼠结肠癌细胞系CT26 ID8同源小鼠卵巢癌模型 CT26同源小鼠结直肠癌模型
重点核对
药物浓度：AZD1775和AZD6738的联合处理浓度（例如50 nM或100 nM） 处理时间：细胞增殖实验72小时，凋亡实验48小时，克隆形成实验10天 动物模型：ID8细胞注射数量（5×10^6）及给药方案（AZD1775 60 mg/kg, AZD6738 25 mg/kg, 口服，5天/2天间歇，28天） 免疫检查点阻断：抗PD-L1（200 μg/小鼠，腹腔注射，每3天一次共6次） STING抑制：H-151（500 nM）或siSTING转染
摘要
WEE1在细胞周期G2/M检查点和DNA损伤反应（DDR）的调控中发挥重要作用。抑制WEE1可增加基因组的不稳定性，并在一些实体瘤中具有抗肿瘤作用。然而，对于来自不同谱系的多种癌细胞，它有一定的局限性。因此，我们考虑利用合成致死相互作用来增强治疗效果。我们的实验证明，WEE1抑制剂（WEE1i）可以激活共济失调毛细血管扩张突变和Rad3相关（ATR）通路，阻断ATR显著增敏WEE1i诱导的细胞死亡。生物可利用的WEE1和ATR抑制剂之间的肿瘤选择性合成致死性在体内导致肿瘤消退。机制上，联合治疗促进了胞质双链DNA的积累，进而激活干扰素基因刺激因子（STING）通路，诱导I型干扰素和CD8+ T细胞的产生，从而诱导抗肿瘤免疫。此外，我们的研究发现免疫检查点程序性死亡配体1被联合治疗上调，阻断PD-L1进一步增强联合治疗的效果。总之，作为免疫调节剂，WEE1i与ATR抑制剂（ATRi）和免疫检查点阻断剂的联合为癌症治疗提供了一种潜在的新方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- WEE1抑制剂与ATR抑制剂联合能否通过STING通路增强抗肿瘤免疫，并与PD-L1阻断协同提高治疗效果？
- 核心机制
- 联合治疗促进胞质双链DNA积累，激活STING-TBK1-IRF3信号轴，诱导I型干扰素和趋化因子产生，进而促进CD8+ T细胞浸润，同时上调PD-L1免疫检查点，阻断PD-L1可进一步增强疗效。
- 主要证据
- 体外实验显示联合治疗协同抑制增殖、诱导凋亡，并激活STING通路；体内同源小鼠模型中联合治疗延迟肿瘤生长，增加TUNEL阳性细胞和CD8+ T细胞浸润；抗PD-L1进一步抑制肿瘤生长，CD8+ T细胞缺失削弱疗效。
- 研究意义
- WEE1i与ATRi联合治疗作为免疫调节剂，与PD-L1阻断联合提供了一种潜在的癌症治疗新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内同源肿瘤模型验证
评估联合治疗在免疫完整小鼠中的抗肿瘤效果
建立ID8同源卵巢癌小鼠模型和CT26皮下结直肠癌模型，口服给药，监测肿瘤生长和体重，肿瘤组织进行免疫组化和TUNEL染色。
DNA损伤和胞质dsDNA检测
阐明联合治疗是否增加DNA损伤并导致胞质dsDNA积累
Western blot检测γH2AX和cleaved PARP-1；PicoGreen染色和免疫荧光观察胞质dsDNA及γH2AX共定位；肿瘤组织双色免疫荧光检测panCK和γH2AX。
STING通路激活验证
验证联合治疗是否通过STING通路介导抗肿瘤作用
免疫荧光和Western blot检测p-TBK1和p-IRF3；siRNA敲低STING或使用H-151抑制STING，观察对通路活化和细胞克隆形成的影响。
免疫微环境重塑评估
评估联合治疗是否诱导I型干扰素反应和T细胞浸润
RT-qPCR检测ISG15、IFI44、CXCL10、CCL5；ELISA检测IFN-β和CXCL10；流式或免疫荧光检测肿瘤中CD8+ T和CD3+ T细胞。
免疫检查点激活与联合阻断
评估联合治疗是否上调PD-L1以及PD-L1阻断能否增强疗效
检测PD-L1和MHC-I表达；在CT26模型中联合抗PD-L1，评估肿瘤生长、增殖、凋亡和T细胞浸润；使用抗CD8清除T细胞验证CD8依赖性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Dojindo Laboratories | CK04 |
| 药物处理 | AZD1775 | Selleck | S1525 |
| AZD6738 | Selleck | S7693 | |
| 细胞凋亡检测 | FITC Annexin V凋亡检测试剂盒I | BD Biosciences | 556547 |
| 流式分析 | 抗MHC-I抗体 | Abcam | ab240087 |
| 免疫荧光 | PicoGreen | Yeasen | 12641ES01 |
| 抗泛细胞角蛋白抗体 | Abcam | ab80826 | |
| 磷酸化组蛋白H2A.X抗体 | CST | 9718 | |
| 磷酸化TBK1抗体 | CST | 5483 | |
| 磷酸化IRF-3抗体 | CST | 29047 | |
| RT-qPCR | iTAQ通用SYBR Green超混合液 | BIO-RAD | -- |
| ELISA | CXCL10 ELISA试剂盒 | NeoBioscience | EMC121.96 (mouse), EHC157 (human) |
| IFNβ ELISA试剂盒 | NeoBioscience | EMC016.96 (mouse), EHC026b.96 (human) | |
| 小鼠PD-L1 ELISA试剂盒 | arigo | ARG81930 | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| STING抑制 | H-151 | Selleck | S6652 |
| 动物实验 | 抗PD-L1抗体 | bioxcell | BP0101 |
| 抗CD8抗体 | bioxcell | BE0061 | |
| 免疫组化 | Ki67抗体 | Abcam | ab16667 |
| PD-L1抗体 | R&D | MAB9078 | |
| CD3抗体 | sigma | SAB5500058 | |
| CD8抗体 | sigma | SAB5500074 | |
| 凋亡检测 | 一步法TUNEL凋亡检测试剂盒 | Beyotime | C1089 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系培养 | 细胞系来源（ATCC或MDACC等），培养基种类和FBS浓度（10% FBS） 阅读提示：Methods 2.1 Cell lines and culture conditions |
| 药物处理浓度和时间 | AZD1775和AZD6738的浓度（如50 nM、100 nM、300 nM），处理时间（增殖72h、凋亡48h、克隆形成10天） 阅读提示：Methods 2.2, 2.3, 2.4, Results 3.1, Figure legends |
| 体内药物给药方案 | 小鼠品系、细胞接种数量和途径、药物剂量（AZD1775 60 mg/kg，AZD6738 25 mg/kg）、给药方式（口服）和周期（5天用药/2天停药，共28天） 阅读提示：Methods 2.10, 2.11, Results 3.2, Figure 2A |
| 免疫检查点阻断 | 抗PD-L1和抗CD8的剂量（200 μg/小鼠）、给药途径（腹腔注射）和频率（抗PD-L1每3天一次共6次，抗CD8每5天一次） 阅读提示：Methods 2.11, Results 3.7, Figure 7A |
| STING通路抑制 | siRNA敲低STING的转染浓度（50 nM）以及H-151浓度（500 nM） 阅读提示：Methods 2.9, Results 3.4, 3.5, 3.6 |