构建B7-H3×PD-L1双特异性抗体
生成IgG1-VHH形式的双特异性抗体，评估其结构、纯度和稳定性。
将人源化抗B7-H3 VHH基因融合至抗PD-L1 IgG1抗体重链C端，用(GGGGGS)3连接子连接；通过HEK293F细胞瞬时表达，Protein A纯化，SDS-PAGE和SEC-HPLC分析纯度，DSF测量Tm值。
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靶向B7-H3和PD-L1的双特异性抗体表现出优异的抗肿瘤活性
Bispecific antibody targeting both B7-H3 and PD-L1 exhibits superior antitumor activities.
实验完整度
高包含分子构建、体外功能验证（T细胞激活、ADCC）、细胞因子释放评估、体内异种移植模型疗效及灵长类毒代动力学等多个独立证据层级。
主要模型
A375人黑色素瘤细胞系 人PBMC人源化NSG小鼠异种移植模型 人CD4+T细胞及树突状细胞共培养体系 食蟹猴毒代动力学模型
重点核对
B7-H3×PD-L1 BsAb的分子结构（IgG1-VHH形式）及纯度 体外T细胞增殖恢复和IFN-γ分泌的诱导浓度 ADCC效应中的效应细胞与靶细胞比例及孵育时间 体内实验中PBMC注射剂量、A375接种时间及给药方案 细胞因子释放实验中BsAb的包被浓度
摘要
PD-1和PD-L1单克隆抗体（mAbs）的临床应用因其相对较低的响应率和耐药性的发生而受阻。已在多种实体瘤中发现B7-H3与PD-L1共表达，同时靶向PD-1/PD-L1和B7-H3通路的联合治疗可能提供额外的治疗获益。然而，迄今为止，尚无同时靶向PD-1和B7-H3的双特异性抗体进入临床开发阶段。在本研究中，我们通过将人源化抗PD-L1 IgG1单克隆抗体与人源化抗人B7-H3骆驼重链抗体可变区（VHH）偶联，生成了一种稳定的IgG1-VHH形式的B7-H3×PD-L1双特异性抗体（BsAb）。该BsAb表现出良好的热稳定性、有效的T细胞激活、IFN-γ产生和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。在PBMC人源化A375异种移植肿瘤模型中，与单一疗法以及某种程度上联合治疗相比，BsAb治疗（10 mg/kg，腹腔注射，每周两次，持续6周）显示出增强的抗肿瘤活性。我们的结果表明，用BsAb同时靶向PD-1和B7-H3可提高其对B7-H3和PD-L1双阳性肿瘤的特异性，并诱导协同效应。我们得出结论，在治疗B7-H3和PD-L1双阳性肿瘤方面，B7-H3×PD-L1 BsAb优于单克隆抗体，甚至可能优于联合治疗。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 同时靶向B7-H3和PD-L1的双特异性抗体能否在体外和体内模型中产生优于单一疗法或联合疗法的抗肿瘤效果？
- 核心机制
- 通过同时阻断PD-L1/PD-1相互作用和靶向B7-H3，增强T细胞激活和ADCC效应，从而产生协同抗肿瘤作用。
- 主要证据
- 体外T细胞增殖实验、MLR中IFN-γ释放、ADCC实验均显示BsAb优于单一抗体；体内PBMC人源化A375模型中，BsAb的肿瘤生长抑制效果优于PD-L1单抗及联合疗法。
- 研究意义
- 作者认为B7-H3×PD-L1 BsAb在治疗B7-H3和PD-L1双阳性肿瘤方面可能优于单抗或联合治疗，为实体瘤免疫治疗提供了潜在的新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估双特异性抗体与抗原的结合活性
验证BsAb同时结合B7-H3和PD-L1的能力及其结合动力学。
通过ELISA检测BsAb与B7-H3和PD-L1结合；桥接ELISA验证同时结合；生物膜层干涉技术（BLI）测定亲和力KD。
体外中性化活性评估
检测BsAb阻断PD-1/PD-L1相互作用的能力。
使用稳定表达人PD-1的CHO细胞进行流式细胞术，以及ELISA检测BsAb阻断PD-L1与PD-1结合的能力。
体外T细胞激活和ADCC功能检测
验证BsAb对T细胞增殖、IFN-γ分泌及ADCC效应的影响。
用抗CD3/抗CD28预包被的板培养CD4+ T细胞，加入BsAb或对照抗体，检测T细胞增殖；混合淋巴细胞反应（MLR）检测IFN-γ释放；ADCC实验检测LDH释放。
体内抗肿瘤活性评估
在PBMC人源化小鼠模型中评估BsAb的体内抗肿瘤效果并与单抗及联合疗法比较。
将人PBMC经尾静脉注射NSG小鼠，3天后皮下接种A375细胞，待肿瘤形成后分组给药，记录肿瘤体积和体重，计算肿瘤生长抑制率（TGI）。
安全性评估和毒代动力学研究
评估BsAb的细胞因子释放风险、毒代动力学特征及毒性。
细胞因子释放实验检测PBMC中IFN-γ、IL-10、IL-2分泌；食蟹猴静脉注射50 mg/kg BsAb，在不同时间点采血，通过ELISA检测血清药物浓度，并进行血液学和血清生化分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Meilunbio | MA0215 |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 10099-141C | |
| 抗体构建 | 人B7-H3重组蛋白（6×His标签） | ABclonal | RP01020 |
| 聚乙烯亚胺“MAX” | BIOHUB | 78PEI4000 | |
| 抗体表达 | OPM-293 CD05培养基 | OPEM | 81075-001 |
| 抗体纯化 | 蛋白A层析柱 | Bestchrom | AA0277 |
| SDS-PAGE | 考马斯亮蓝 | BioFroxx | 6104-59-2 |
| SEC-HPLC | 1260高效液相色谱系统 | Agilent | -- |
| DSF | SYPRO Orange染料 | Merk | S5692 |
| 结合ELISA | 酪蛋白封闭液 | Thermo Fisher Scientific | 37528 |
| HRP偶联的羊抗人IgG（H+L）抗体 | ABclonal | AS002 | |
| SpectraMax M5e多功能酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| BLI | Octet Red 96分子相互作用分析仪 | Fortebio | -- |
| 蛋白A生物传感器 | Sartorius | -- | |
| 阻断ELISA | HRP标记链霉亲和素 | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 |
| 流式细胞术 | PE标记抗人IgG Fc抗体 | BioLegend | 410708 |
| FACScan流式细胞仪 | BD | -- | |
| PE标记链霉亲和素 | BioLegend | 40523 | |
| 细胞培养 | 干扰素-γ | Sino Biological | 11725-HNAS |
| MLR | 单核细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-096-537 |
| 白介素-4 | Peprotech | 200-04 | |
| 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | Peprotech | 300-03 | |
| 脂多糖 | Sigma-Aldrich | L6529 | |
| Dynabeads CD4阳性分离试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 11331D | |
| IFN-γ ELISA试剂盒 | Neobioscience | EHC102g | |
| T细胞激活实验 | 抗CD28抗体（克隆号CD28.2） | Thermo Fisher Scientific | 14-0289-82 |
| 抗CD3抗体（克隆号HIT3a） | Thermo Fisher Scientific | 16-0039-81 | |
| 人PD-L1蛋白 | ABclonal | RP00068 | |
| CCK-8细胞计数试剂盒 | Dojindo Laboratories | CK04 | |
| ADCC实验 | Ficoll分离液 | Sigma-Aldrich | F4375 |
| NK细胞分选磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-092-657 | |
| LDH细胞毒性检测试剂盒 | Roche | 11644793001 | |
| 细胞因子释放实验 | IFN-γ、IL-10和IL-2 ELISA试剂盒 | Neobioscience | -- |
| 毒代动力学研究 | JCA-BM6010C血液分析仪 | SYSMEX | -- |
| Cedex Bio生化分析仪 | Roche | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 抗体构建与纯化 | VHH和mAb的氨基酸序列、质粒载体、表达系统（HEK293F）、纯化方法及缓冲液 阅读提示：见Materials and methods中的"Construction, expression, and purification of B7-H3×PD-L1 BsAb" |
| T细胞激活实验 | 抗CD3、抗CD28和PD-L1的包被浓度，CD4+ T细胞分离方法，抗体浓度（500 nM），培养时间（4天） 阅读提示：见Materials and methods中的"T-cell activation assay"及结果图4a |
| MLR实验 | 单核细胞分离方法，DC诱导条件（IL-4，GM-CSF），成熟条件（GM-CSF，IFN-γ，LPS），CD4+ T细胞分离方法，细胞共培养比例，抗体浓度（1,10,100 nM），培养时间（5天） 阅读提示：见Materials and methods中的"Mixed leukocyte reaction (MLR)"及结果图4b |
| ADCC实验 | NK细胞分离方法，靶细胞（A375等）与效应细胞（PBMC/NK）的比例，抗体浓度（1,10,100 nM），孵育时间（18小时） 阅读提示：见Materials and methods中的"ADCC assay"及结果图4c |
| 体内异种移植模型 | NSG小鼠品系、周龄、性别，PBMC注射数量和途径，A375细胞接种时间，给药剂量和频率（BsAb 10 mg/kg，i.p.，每周两次），分组设置，肿瘤测量方式及TGI计算 阅读提示：见Materials and methods中的"Tumor xenograft model in human PBMC-reconstituted NSG mice"及结果图5 |