真实环境PM暴露模型建立与病理评估
建立亚慢性PM暴露动物模型并确认慢性肺损伤发生
C57BL/6J雄性小鼠置于石家庄真实环境PM暴露系统，与过滤空气对照组比较，进行8周和16周暴露，通过H&E、Masson染色、胶原含量、羟脯氨酸含量等评估病理变化。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
单细胞转录组学揭示IL-17A在真实环境颗粒物暴露所致慢性肺损伤起始中的免疫失调介导作用
Single-cell transcriptomics reveals immune dysregulation mediated by IL-17A in initiation of chronic lung injuries upon real-ambient particulate matter exposure.
实验完整度
高包含体内动物模型（PM暴露与IL-17A敲除）、单细胞转录组学、病理学、流式、功能学验证等多层级证据
主要模型
C57BL/6J小鼠（真实环境PM暴露模型） IL-17A−/−小鼠 小鼠全肺单细胞转录组
重点核对
PM暴露时间点（11、15、23天，8周，16周）及分组（各时间点N=20） PM2.5暴露浓度（暴露舱内平均73.94 μg/m³） IL-17A敲除验证（mRNA表达降低87%） 胶原含量、Ashcroft评分、羟脯氨酸含量 MDSCs流式标记（CD11b+Gr1+，Ly6C/Ly6G亚型）
摘要
背景：长期暴露于细颗粒物（PM2.5）会增加慢性呼吸系统疾病（包括炎症和间质纤维化）的易感性。然而，免疫反应介导肺纤维化起始的调控机制尚未完全阐明。本研究旨在阐明PM暴露小鼠中不同细胞簇与关键通路在触发慢性肺损伤中的相互作用。结果：将6周龄C57BL/6J雄性小鼠暴露于PM或过滤空气16周，暴露系统位于中国石家庄的真实环境PM暴露系统。通过单细胞转录组学分析表征亚慢性PM暴露后全肺细胞的转录谱。利用IL-17A敲除（IL-17A−/−）小鼠模型确定IL-17信号通路是否介导PM诱导的慢性肺损伤中的免疫失调。16周PM暴露后，出现慢性肺损伤，伴有过度胶原沉积、成纤维细胞、中性粒细胞和单核细胞增加，同时主要免疫细胞类别数量减少。单细胞分析显示，IL-17信号通路的激活参与亚慢性PM暴露下肺纤维化的进展。IL-17A缺失导致慢性肺损伤显著减轻，这主要由髓源性抑制细胞（MDSCs）募集减少和TGF-β下调所触发。结论：这些新发现表明，通过IL-17A通路的免疫抑制在亚慢性PM暴露所致慢性肺损伤的起始中发挥关键作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 真实环境PM暴露如何通过免疫调控触发慢性肺损伤及肺纤维化的起始？
- 核心机制
- IL-17A信号通路激活，募集免疫抑制性MDSCs，上调TGF-β，形成免疫抑制微环境，促进成纤维细胞活化与胶原沉积。
- 主要证据
- 16周PM暴露小鼠肺组织出现纤维化改变，IL-17A−/−小鼠纤维化减轻；scRNA-seq显示IL-17信号通路在多种细胞簇激活；MDSCs骨髓、脾、肺中增加，IL-17A缺失后减少；TGF-β分泌下降。
- 研究意义
- 为理解环境颗粒物暴露相关慢性肺损伤的免疫调控机制提供新见解，IL-17A可作为潜在生物标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞转录组分析全肺细胞图谱
揭示PM暴露后肺细胞组成变化和关键信号通路激活
对对照组和PM暴露组（各3只）全肺细胞进行scRNA-seq，聚类鉴定13个细胞簇，分析差异表达基因、GO/KEGG富集及细胞间通讯。
IL-17A敲除验证其功能作用
验证IL-17A在PM诱导慢性肺损伤中的必要性
将IL-17A−/−小鼠与WT小鼠共同暴露于PM8周和16周，评估炎症评分、胶原含量、羟脯氨酸含量、TGF-β水平等。
MDSCs募集及免疫抑制功能检测
明确IL-17A对MDSCs募集及其免疫抑制功能的影响
通过流式细胞术检测骨髓、脾、肺中MDSCs比例，分离MDSCs与T细胞共培养，检测T细胞增殖抑制和TGF-β分泌。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| PM暴露系统监测 | DUSTTRAK II气溶胶检测仪 | TSI Incorporated | -- |
| 肺组织解离 | 胶原酶/分散酶 | Roche | -- |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma Aldrich | -- | |
| scRNA-seq文库制备 | Chromium单细胞3' v3试剂盒 | 10x Genomics | -- |
| scRNA-seq测序 | NovaSeq6000 | Illumina | -- |
| 羟脯氨酸和胶原检测 | 羟脯氨酸检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- |
| I型胶原检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 流式细胞术 | Cytoflex流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| FACS Aria III流式分选仪 | BD Biosciences | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher | -- |
| Advantage RT-for-PCR试剂盒 | Takara | -- | |
| SYBR Green PCR预混液 | Toyobo | -- | |
| 细胞增殖检测 | CellTrace™ CFSE细胞增殖染料 | Invitrogen | -- |
| ELISA | ELISA试剂盒 | Neobioscience | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PM暴露模型 | PM2.5暴露浓度（舱内平均73.94 μg/m³）、暴露持续时间（16周）、小鼠品系（C57BL/6J雄性）、周龄（6周龄） 阅读提示：Methods: Animals and real-ambient PM exposure; Figure 1 |
| 病理评估 | 各组样本量（N=8）、染色方法（H&E、Masson三色、天狼星红）、评分标准（ALI评分、Ashcroft评分）、胶原含量计算 阅读提示：Methods: Histopathological analysis; Figure 2 |
| scRNA-seq | 每组样本量（N=3）、建库试剂盒（10x Genomics）、测序深度（500M）、细胞存活率、质量控制标准（基因数500-6500，线粒体基因<10%） 阅读提示：Methods: ScRNA-seq library preparation and sequencing; ScRNA-seq data processing |
| IL-17A敲除验证 | IL-17A敲除效率（mRNA降低87%）、敲除小鼠来源（第三军医大学） 阅读提示：Methods: Animals and real-ambient PM exposure; Additional file 1: Fig. S6 |
| MDSCs检测 | 流式标记（CD11b+Gr1+、Ly6C/Ly6G亚型）、样本来源（骨髓、脾、肺）、样本量（N=4） 阅读提示：Methods: Flow cytometry analysis; Figure 7 |
| MDSCs功能实验 | 共培养比例（MDSCs:T=1:2）、时间（72h）、T细胞增殖检测（CFSE稀释）、TGF-β检测 阅读提示：Methods: Functional assays for MDSCs; Figure 7 |