hESC三维悬浮分化成肝母细胞类器官
建立hESC来源的肝母细胞类器官模型，并比较有无Matrigel的影响。
将H9 hESC聚集体经定型内胚层、肝母细胞分化，再在添加或不添加5% Matrigel的扩增培养基中培养，观察形态和增殖。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
三维悬浮条件下Matrigel的不同作用使得人胚胎干细胞能够产生可扩增的肝母细胞和极化的肝细胞类器官。
Distinct Roles of Matrigel Enabled the Production of Expandable Hepatoblast and Polarized Hepatocyte Organoids from Human Embryonic Stem Cells under 3-Dimensional Suspension Conditions.
实验完整度
高体外细胞实验（hESC分化）、类器官培养、多种功能检测（ELISA、CYP活性）、RNA-seq、抑制剂验证、TEM结构分析等多层级验证。
主要模型
H9人胚胎干细胞系 肝母细胞类器官（HB-orgs） 极化肝细胞类器官（P-hep-orgs） 原代人肝细胞（PHHs）
重点核对
低浓度Matrigel（5% vol/vol）的添加 三维悬浮培养条件（超低附着板） 细胞密度（2×10^5 cells/ml） 分化时间（6天） 生长因子和抑制剂浓度（如CHIR99021、SB431542等）
摘要
肝脏对于一系列代谢功能至关重要，近年来类器官技术的进步使得各种肝脏类器官的发展成为可能。然而，在肝脏类器官培养中，复制体内微环境（尤其是细胞外基质）的挑战仍然重要。在本研究中，我们探讨了Matrigel（一种常用的细胞外基质成分）在人胚胎干细胞（hESCs）来源的肝脏类器官在三维悬浮条件下的扩增、极化和功能成熟中的作用。通过多种检测方法，我们证明低浓度的Matrigel通过抑制ROS-AMPK-mTOR介导的过度自噬，调节活性氧（ROS）-自噬稳态，从而支持hESC来源的肝母细胞类器官的有效扩增。此外，Matrigel通过激活FAK-ERK-AMPK通路，在三维悬浮条件下诱导了由hESC来源的可扩增肝母细胞类器官分化而来的成熟肝细胞类器官的极化。我们的研究结果强调了整合素信号在肝细胞类器官培养中的重要性，并为开发用于临床应用的肝细胞大规模生产的人工、合成、生物活性水凝胶提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Matrigel在三维悬浮条件下如何影响hESC来源的肝母细胞类器官的扩增以及成熟肝细胞类器官的极化和功能成熟？
- 核心机制
- Matrigel通过抑制ROS-AMPK-mTOR介导的过度自噬维持ROS-自噬稳态，促进肝母细胞类器官扩增；并通过激活整合素-FAK-ERK-AMPK通路诱导肝细胞类器官极化。
- 主要证据
- RNA-seq分析显示无Matrigel培养的HB-orgs自噬和衰老相关基因上调；Western blot验证AMPK-mTOR通路变化；GRGDSP抑制整合素信号后极化标记物表达下降；CDFDA染色和TEM证实极化结构。
- 研究意义
- 研究揭示了ECM在肝细胞类器官中的关键作用，为开发合成生物活性水凝胶以大规模生产肝细胞用于临床应用提供了见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估Matrigel对肝母细胞类器官增殖的影响
验证低浓度Matrigel是否支持HB-orgs的长期扩增。
比较有无Matrigel培养的HB-orgs的细胞活力、细胞周期、凋亡、衰老和自噬水平。
分析Matrigel对肝母细胞类器官转录组的影响
揭示Matrigel调控HB-orgs扩增的分子机制。
对有无Matrigel培养的HB-orgs进行RNA-seq，分析差异表达基因、KEGG通路和GSEA。
验证ROS-自噬机制
确认Matrigel通过抑制ROS-AMPK-mTOR通路维持ROS-自噬稳态。
检测ROS水平、溶酶体活性、自噬相关蛋白表达，并应用抑制剂或激活剂观察对扩增的影响。
分化成极化和非极化肝细胞类器官
比较有无Matrigel对肝细胞极化和成熟的影响。
将HB-orgs在有无Matrigel的肝细胞培养基中分化6天，形成P-hep-orgs和NP-hep-spheres，并通过免疫荧光、TEM、CDFDA染色评估极化结构。
评估肝细胞功能和药物毒性反应
验证P-hep-orgs的功能成熟度及其在药物毒性筛选中的实用性。
检测ALB分泌、胆汁酸产生、尿素合成、CYP活性、ICG摄取排泄、糖原储存；并用肝毒性化合物处理，测定TC50和MOS值。
揭示极化机制：整合素-FAK-ERK-AMPK途径
确认Matrigel通过整合素信号促进肝细胞极化。
使用GRGDSP抑制整合素，检测极化标志物和信号通路蛋白的变化；并调节AMPK活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 85850 |
| Matrigel（生长因子减少型） | Corning | 354230 | |
| 细胞分化 | CHIR99021 | MedChemExpress | HY-10182 |
| SB431542 | MedChemExpress | HY-10431 | |
| 毛喉素 | MedChemExpress | HY-15371 | |
| 细胞培养 | Y27632 | MedChemExpress | HY-10071 |
| DMEM/F12培养基 | Gibco | C11330500BT | |
| 血清替代物 | Gibco | 10828028 | |
| 非必需氨基酸 | Gibco | 11140050 | |
| 谷氨酰胺补充剂 | Gibco | 35050061 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | PeproTech | 100-18B | |
| 胶原酶IV | Gibco | C0130 | |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | C11875500BT | |
| 激活素A | PeproTech | 120-14 | |
| IMDM培养基 | Gibco | C12440500BT | |
| 胎牛血清 | ExCell Bio | FND500 | |
| 1-硫代甘油 | Sigma | M6145 | |
| 地塞米松 | Sigma | D4902 | |
| 二甲基亚砜 | MP Biomedical | 196055 | |
| 人胰岛素 | Sigma | 91077C | |
| 成纤维细胞生长因子4 | PeproTech | 100-31 | |
| 肝细胞生长因子 | PeproTech | 100-39 | |
| 骨形态发生蛋白2 | PeproTech | 120-02 | |
| 骨形态发生蛋白4 | PeproTech | 120-05 | |
| TrypLE消化液 | Gibco | 12604021 | |
| 烟酰胺 | Sigma | N0636 | |
| 表皮生长因子 | PeproTech | AF-100-15 | |
| 肝细胞培养基 | Lonza | CC-3199 | |
| SingleQuots补充剂 | Lonza | CC-4182 | |
| B27补充剂 | Gibco | 17504044 | |
| 制瘤素M | PeproTech | 300-10 | |
| 温和细胞解离试剂 | Stem Cell Technologies | 100-0485 | |
| 超低吸附6孔板 | Corning | 3471 | |
| 超低吸附96孔板 | Corning | 3474 | |
| 细胞活力检测 | 3D细胞活力检测试剂盒 | Promega | G9681 |
| 药物处理 | 甘露醇 | MedChemExpress | HY-N0378 |
| 曲格列酮 | MedChemExpress | HY-50935 | |
| 氯丙嗪 | Selleck | S5749 | |
| 双氯芬酸 | MedChemExpress | HY-15036 | |
| 环孢素A | MedChemExpress | HY-B0579 | |
| 奈法唑酮 | MedChemExpress | HY-B1396 | |
| 托卡朋 | MedChemExpress | HY-17406 | |
| 波生坦 | MedChemExpress | HY-A0013 | |
| 染色分析 | 5(6)-羧基-2',7'-二氯荧光素二乙酸酯 | Sigma | 21884 |
| PCR | RNAiso Plus | Takara | 9109 |
| PrimeScript逆转录预混液 | Takara | RR036B | |
| PowerUp SYBR Green | Thermo | A25742 | |
| 流式分析 | 转录因子染色缓冲液套装 | Invitrogen | 00-5523-00 |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | -- | -- |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1006 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | R0020 |
| 蛋白酶抑制剂 | Beyotime Biotechnology | P1005 | |
| 磷酸酶抑制剂 | Beyotime Biotechnology | P1081 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Biosharp | BL521A | |
| 功能检测 | 人白蛋白ELISA定量试剂盒 | Bethyl | E88-129 |
| 总胆汁酸检测试剂盒 | NjjcBio | E003-2-1 | |
| 氯化铵 | Sigma | A9434 | |
| 尿素检测试剂盒 | Solarbio | BC1535 | |
| PAS染色试剂盒 | Beyotime Biotechnology | C0142S | |
| 吲哚菁绿 | MedChemExpress | HY-D0711 | |
| 利福平 | Sigma | R3501 | |
| 奥美拉唑 | Sigma | O104 | |
| P450-Glo检测试剂盒 | Promega | V9002, V8422, V8791 | |
| 细胞周期分析 | 细胞周期分析试剂盒 | Beyotime Biotechnology | C1052 |
| 衰老检测 | SA-β-gal染色试剂盒 | Beyotime Biotechnology | C0602 |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | C1062M |
| ROS检测 | 活性氧检测试剂盒 | NjjcBio | E004-1-1 |
| 溶酶体检测 | Lyso-Tracker Red | Beyotime Biotechnology | C1046 |
| 凋亡检测 | 一步法TUNEL凋亡检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | C1086 |
| RNA-seq | NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒 | NEB | E7530 |
| 抑制剂处理 | GRGDSP肽 | -- | -- |
| AICAR | -- | -- | |
| SR9242 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与分化 | H9细胞培养条件（饲养层、培养基），分化过程中细胞密度、培养基成分、生长因子浓度 阅读提示：Materials and Methods: Cell culture; Differentiation of HB-orgs |
| 类器官扩增 | Matrigel浓度（5% vol/vol），细胞密度，培养基成分（HB-expansion medium），传代比例和频率 阅读提示：Materials and Methods: Differentiation of HB-orgs |
| 极化诱导 | 分化培养基成分，Matrigel添加，分化时间（至少6天） 阅读提示：Materials and Methods: Differentiation of HB-orgs into P-hep-orgs |
| 功能检测 | 检测试剂盒型号，培养时间点，诱导剂浓度（rifampicin 25μM, omeprazole 100μM） 阅读提示：Materials and Methods: Analysis of liver function |
| 药物毒性检测 | 细胞数量（10-20个类器官/孔），药物浓度梯度，处理时间（48小时），细胞活力测定方法 阅读提示：Materials and Methods: Assessment of the cytotoxicity of drugs |