体内感染模型评估菌株致病性
比较M. bovis N#与C68004#菌株在小鼠中的致病性和组织坏死情况
C57BL/6小鼠经鼻感染M. bovis N#或C68004#菌株（2000 CFU），在14天和28天时检测肺和脾脏的CFU、细胞因子水平（IFNG、TNF、IL1B）、大体病理、组织病理（H&E染色、Ziehl-Neelsen染色）及肺细胞坏死。
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牛分枝杆菌Mb3523c蛋白通过分子伴侣介导的自噬调控宿主铁死亡
Mycobacterium bovis Mb3523c protein regulates host ferroptosis via chaperone-mediated autophagy.
实验完整度
高包含细胞感染模型、基因敲除与回补、体内小鼠模型、蛋白质互作与机制验证等多层级实验。
主要模型
RAW264.7小鼠巨噬细胞 A549人肺腺癌细胞 HEK293T细胞 C57BL/6小鼠
重点核对
M. bovis N#与C68004#菌株感染小鼠模型，感染剂量2000 CFU，经鼻接种 RAW264.7细胞感染MOI 10，24小时 Fer-1（10μM）、Nec-1（40μM）、VX-765（50μM）、apoptozole（30μM）、tanespimycin（0.5μM）、CQ（12.5μM）、MG-132（200nM）预处理3小时 体内实验中，Fer-1（3mg/kg）和tanespimycin（5mg/kg）腹腔注射每日，从感染后第15天开始 蛋白互作验证：免疫共沉淀（Co-IP）、质谱分析、AlphaFold2预测及点突变
摘要
牛分枝杆菌感染期间发生的坏死被认为对宿主有害，因为它促进了牛分枝杆菌的传播。铁死亡是一种受调控的细胞死亡类型，当游离铁和有害脂质过氧化物过度积累时发生。在这里，我们证明哺乳动物细胞进入（Mce）4家族蛋白Mb3523c触发铁死亡以促进牛分枝杆菌的致病性和传播。机制上，Mb3523c通过其Y237和G241位点与宿主HSP90蛋白相互作用，稳定溶酶体上的LAMP2A，从而促进分子伴侣介导的自噬（CMA）通路。然后，GPX4通过CMA通路被递送至溶酶体降解，最终诱导铁死亡以促进牛分枝杆菌的传播。总之，我们的发现为病原体诱导的铁死亡分子机制提供了新的见解，表明通过阻断牛分枝杆菌Mb3523c-宿主HSP90界面来靶向GPX4依赖性铁死亡是结核病（TB）的潜在治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 牛分枝杆菌Mb3523c蛋白如何调控宿主细胞铁死亡，从而影响病原体的致病性和传播？
- 核心机制
- Mb3523c通过其Y237和G241位点与宿主HSP90蛋白相互作用，稳定溶酶体上的LAMP2A，激活分子伴侣介导的自噬（CMA）通路，导致GPX4被递送至溶酶体降解，最终诱导铁死亡。
- 主要证据
- 在RAW264.7细胞和C57BL/6小鼠模型中，与ΔMb3523c菌株相比，表达Mb3523c的菌株（N#、ΔMb3523c: Mb3523c）感染导致GPX4表达下降、脂质过氧化物和Fe2+水平升高，并表现出更严重的肺部坏死和更高的细菌载量；Co-IP和点突变实验确定Y237和G241为关键氨基酸位点。
- 研究意义
- 研究揭示了病原体诱导铁死亡的分子机制，表明通过阻断Mb3523c-HSP90界面靶向GPX4依赖性铁死亡是结核病的潜在治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞感染模型确定坏死路径
确定M. bovis诱导的细胞死亡类型及其通路
RAW264.7细胞以MOI 10感染M. bovis N#或C68004#菌株24小时，检测细胞死亡（Live/Dead染色、LDH释放）、细胞因子水平、坏死性凋亡标志物（p-MLKL）、铁死亡标志物GPX4；使用抑制剂Fer-1、Nec-1、VX-765处理。
Mb3523c基因敲除与回补实验验证铁死亡依赖性
验证Mb3523c蛋白是否通过铁死亡途径诱导细胞坏死
在M. bovis N#中敲除Mb3523c基因（ΔMb3523c）并构建回补株（ΔMb3523c: Mb3523c），在RAW264.7细胞中感染这些菌株（MOI 10），检测细胞死亡、LDH释放、脂质过氧化物（C11 BODIPY）、GPX4表达、Fe2+水平和细菌载量。
RNA-seq和溶酶体通路研究
探究Mb3523c降解GPX4是否通过溶酶体通路
对感染M. bovis N#和ΔMb3523c的RAW264.7细胞进行RNA-seq分析，KEGG富集显示溶酶体通路相关基因下调；检测LAMP1表达；使用溶酶体抑制剂CQ和蛋白酶体抑制剂MG-132处理，检测GPX4蛋白水平。
蛋白互作与机制验证
鉴定Mb3523c互作蛋白并验证其通过HSP90调控CMA通路
在HEK293T细胞中表达HA-Mb3523c，免疫沉淀-质谱（IP-MS）鉴定互作蛋白，发现HSP90；通过Co-IP和共定位实验验证互作；使用HSP90抑制剂tanespimycin、CMA抑制剂apoptozole、HSP90 siRNA处理感染细胞，检测GPX4、HSP90、LAMP2A、HSPA8水平；分离溶酶体检测GPX4含量。
关键氨基酸位点鉴定
确定Mb3523c与HSP90互作的关键结构和氨基酸位点
利用AlphaFold2预测蛋白质结构，构建Mb3523c截短突变体和点突变体（N158A、N162A、Y216A、L235A、Y237A、G241A），通过Co-IP验证与HSP90的互作。
体内验证铁死亡在致病性与播散中的作用
评估Mb3523c诱导的铁死亡对小鼠肺坏死和细菌播散的影响
C57BL/6小鼠感染M. bovis N#、ΔMb3523c或ΔMb3523c: Mb3523c菌株，给予Fer-1或tanespimycin处理，检测肺和脾脏CFU、组织病理、4-HNE免疫组化、GPX4和HSP90蛋白水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证免疫效应
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细菌培养 | Middlebrook 7H9培养基 | BD | 271310 |
| 油酸-白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶 | BD Biosciences | 212351 | |
| 吐温-80 | G-CLONE | CS9029 | |
| Middlebrook 7H10琼脂 | BD | 262710 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Invitrogen | C11995500BT |
| 胎牛血清 | Gibco | 16000-044 | |
| 青霉素 | Sigma-Aldrich | 516106 | |
| 菌株构建 | 潮霉素 | Sigma | H7772 |
| 染色 | 抗酸染色液 | Solarbio | G1274 |
| 脂质过氧化检测 | C11 BODIPY 581/591探针 | Cayman Chemical | 217075-36-0 |
| 细胞染色 | DAPI染料 | Beyotime | C1002 |
| Fe2+检测 | FerroOrange探针 | DojinDo | F374 |
| 细胞死亡检测 | 活/死可固定蓝色死细胞染色试剂盒 | Solarbio | CA1630 |
| 抑制剂处理 | 铁死亡抑制剂-1 | Mce | HY-100579 |
| 坏死性凋亡抑制剂-1 | Mce | HY-15760 | |
| 凋亡素 | Mce | HY-15098 | |
| 坦螺旋霉素 | Mce | HY-10211 | |
| 氯喹 | Mce | HY-17589A | |
| MG-132 | Mce | HY-13259 | |
| VX-765 | Mce | SHY-13205 | |
| 细菌标记 | 异硫氰酸荧光素 | Solarbio | 3326-32-7 |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 594标记亲和纯化驴抗小鼠IgG | Invitrogen | A20000 |
| 免疫印迹 | 抗HA抗体 | Abmart | M20003 |
| 抗TUBA抗体 | Sigma-Aldrich | T6199 | |
| 抗GPX4抗体 | ABclonal | A11243 | |
| 抗HSP90抗体 | nature bioscience | A92707 | |
| 抗HSPA8抗体 | Abmart | T58015 | |
| 抗LAMP1抗体 | Proteintech | 67300-1-Ig | |
| 抗LAMP2A抗体 | Abmart | TN24835 | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 免疫组化 | 抗4-HNE抗体 | Abcam | ab46545 |
| 免疫印迹 | 抗GSDMD抗体 | Abcam | Ab209845 |
| 抗CASP1抗体 | Proteintech | 22915-1-AP | |
| 抗p-MLKL抗体 | Abcam | Ab196436 | |
| 抗MLKL抗体 | Abcam | Ab184718 | |
| 抗GFP抗体 | Abmart | M20003 | |
| 细菌感染 | 磷酸盐缓冲液 | Solarbio | P1020 |
| CFU测定 | 曲拉通X-100 | Solarbio | T8200 |
| 组织匀浆 | 净信科技组织匀浆仪 | Jing Xin Technology | JXFSTPRP-CL |
| 免疫组化检测试剂盒 | 免疫组织化学染色试剂盒 | Gene technology | GK600710 |
| ELISA | 小鼠IL1B ELISA试剂盒 | Mlbio | MM-0040M1 |
| 小鼠IFNG ELISA试剂盒 | Mlbio | MM-0182M1 | |
| 小鼠TNF ELISA试剂盒 | Neobioscience | 560301 | |
| 细胞死亡检测 | 碘化丙啶 | -- | -- |
| 流式分析 | RPMI-1640培养基 | ThermoFisher scientific | C22400500BT |
| 胶原酶1A | Solarbio | C8140 | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Solarbio | D8071 | |
| 免疫沉淀 | 免疫沉淀缓冲液 | Beyotime | P1003 |
| 蛋白A/G琼脂糖 | Cell Signaling Technology | 37478P | |
| 免疫印迹 | PVDF膜 | Millipore | IEVH85R |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | Cell Signaling Technology | 2729 | |
| ChemiDoc XRS系统 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫荧光 | 含DAPI的抗荧光淬灭封片剂 | Solarbio | YA0170 |
| RNA测序 | TRIzol试剂 | Vazyme | 15596-026 |
| 溶酶体分离 | 溶酶体分离试剂盒 | BestBio | BB3603 |
| 转染 | Lipo3000转染试剂 | Invitrogen | L3000075 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物感染模型 | 小鼠品系（C57BL/6），性别（雌性），年龄（6-8周龄），接种菌株（M. bovis N#, C68004#, ΔMb3523c, ΔMb3523c: Mb3523c），接种剂量（2000 CFU），接种途径（鼻内），感染时间（14或28天） 阅读提示：Materials and methods - Mouse model |
| 细胞感染模型 | 细胞系（RAW264.7），感染复数（MOI 10），感染时间（24小时），培养基（DMEM+2%FBS），感染后处理（PBS洗三次） 阅读提示：Materials and methods - Bacterial infection and CFU assay |
| 抑制剂处理 | Fer-1浓度（10μM），Nec-1浓度（40μM），VX-765浓度（50μM），apoptozole浓度（30μM），tanespimycin浓度（0.5μM），CQ浓度（12.5μM），MG-132浓度（200nM），预处理时间（3小时） 阅读提示：Materials and methods - Bacterial infection and CFU assay |
| 体内抑制剂给药 | Fer-1剂量（3mg/kg），tanespimycin剂量（5mg/kg），给药途径（腹腔注射），给药频率（每日），给药起始时间（感染后第15天） 阅读提示：Materials and methods - Mouse model |
| 蛋白互作验证 | HEK293T细胞转染质粒（PCMV-Mb3523c及突变体），转染时间（24小时），Co-IP抗体（anti-HA或anti-GFP），点突变位点（N158A, N162A, Y216A, L235A, Y237A, G241A） 阅读提示：Materials and methods - Plasmids and small interference RNA transfection |