筛选上调PP6的天然化合物
从天然化合物库中筛选能够上调角质形成细胞中PP6表达的化合物。
在R848存在下，用Tsbiochem库中的天然化合物处理HaCaT细胞，通过免疫印迹检测PP6蛋白水平，发现10 μM L-薄荷醇显著上调PP6。
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L-薄荷醇靶向转录因子HES1恢复银屑病模型角质形成细胞中的蛋白磷酸酶6
Targeting the transcription factor HES1 by L-menthol restores protein phosphatase 6 in keratinocytes in models of psoriasis.
实验完整度
高包含体外细胞实验、3D皮肤模型、小鼠模型和患者样本，并通过DARTS、MST、免疫共沉淀、荧光素酶报告基因等进行了靶标和机制验证。
主要模型
HaCaT细胞 原代小鼠角质形成细胞 正常人表皮角质形成细胞(NHEK) 咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病小鼠模型 银屑病样3D人皮肤等效模型
重点核对
L-薄荷醇处理浓度10 μM，处理时间12小时 IMQ诱导小鼠模型，L-薄荷醇局部给药剂量50 μg/天，持续7天 Pp6条件敲除小鼠(K5.Pp6fl/fl)和Hes1条件敲除小鼠(K5.Hes1fl/fl) HES1与L-薄荷醇结合的平衡解离常数(Kd)为16.8 nM HES1蛋白在银屑病患者表皮中表达降低
摘要
蛋白磷酸酶6在角质形成细胞中的下调是放大银屑病炎症回路的关键事件，表明恢复蛋白磷酸酶6可作为银屑病治疗的合理策略。通过表型筛选，我们在此鉴定了L-薄荷醇，它通过增加角质形成细胞中的蛋白磷酸酶6来改善银屑病样皮肤炎症。靶标鉴定方法揭示了转录因子发状分裂增强子1在角质形成细胞中调控L-薄荷醇上调蛋白磷酸酶6功能中不可或缺的作用。转录因子发状分裂增强子1在银屑病患者的表皮和咪喹莫特诱导的小鼠模型中减少，而L-薄荷醇通过阻止其蛋白酶体降解上调转录因子发状分裂增强子1。机制上，转录因子发状分裂增强子1转录激活免疫球蛋白结合蛋白1的表达，后者促进蛋白磷酸酶6的表达并抑制其泛素化。总之，我们发现了治疗银屑病的治疗性化合物L-薄荷醇，并通过使用L-薄荷醇作为探针，揭示了导致银屑病病理的功能失调的转录因子发状分裂增强子1-免疫球蛋白结合蛋白1-蛋白磷酸酶6轴。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- L-薄荷醇能否通过上调PP6改善银屑病样皮肤炎症，其分子机制是什么？
- 核心机制
- L-薄荷醇直接靶向转录因子HES1，通过抑制其蛋白酶体降解上调HES1，进而转录激活IGBP1表达，IGBP1通过抑制PP6的泛素化（可能通过干扰CHIP结合）来促进PP6表达，从而减轻银屑病炎症。
- 主要证据
- 在IMQ诱导的小鼠模型中，L-薄荷醇局部应用减轻皮肤炎症并上调表皮PP6；在Pp6或Hes1条件敲除小鼠中，L-薄荷醇的疗效消失；HES1通过转录激活IGBP1促进PP6表达，且IGBP1过表达抑制PP6泛素化。
- 研究意义
- 研究鉴定出L-薄荷醇作为银屑病的潜在治疗化合物，并揭示了HES1-IGBP1-PP6轴在银屑病病理中的功能失调，为银屑病治疗提供了新的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证L-薄荷醇对银屑病样皮肤炎症的改善作用
评估L-薄荷醇对IMQ诱导的银屑病小鼠模型的治疗效果。
在IMQ诱导的小鼠模型上，局部应用L-薄荷醇（50 μg/天）或乙醇对照，检测耳朵厚度、组织病理学、Ki67+细胞计数和炎症因子水平。
验证PP6在L-薄荷醇疗效中的必要性
确定PP6是否为L-薄荷醇改善银屑病样皮肤炎症所必需。
使用角质形成细胞特异性Pp6敲除小鼠（K5.Pp6fl/fl）和对照小鼠，在IMQ诱导下局部应用L-薄荷醇，比较皮肤炎症表型和PP6水平。
鉴定L-薄荷醇的直接靶标HES1
确定L-薄荷醇在角质形成细胞中的直接结合蛋白。
使用DARTS和质谱鉴定出HES1，并通过免疫印迹、MST实验验证了L-薄荷醇与HES1的直接结合。
验证L-薄荷醇对HES1的上调作用及机制
探究L-薄荷醇如何上调角质形成细胞中的HES1表达。
在R848存在下，检测L-薄荷醇处理对HES1蛋白和mRNA水平的影响，并通过MG132和CHX实验证明L-薄荷醇通过抑制蛋白酶体降解来稳定HES1。
验证HES1在L-薄荷醇上调PP6中的必要性
确定HES1是否为L-薄荷醇上调PP6和改善皮肤炎症所必需。
使用Hes1条件敲除小鼠（K5.Hes1fl/fl）和对照小鼠，在IMQ诱导下应用L-薄荷醇，检测PP6水平和皮肤炎症表型。
鉴定HES1的靶基因IGBP1并验证转录激活
确定HES1是否通过转录激活IGBP1来调节PP6。
通过质谱和GeneMANIA分析鉴定PP6相互作用蛋白，发现IGBP1；使用荧光素酶报告基因和qPCR验证HES1直接结合IGBP1启动子并激活其转录。
验证IGBP1对PP6表达的促进作用
确定IGBP1是否促进角质形成细胞中PP6的表达并抑制其泛素化。
通过siRNA敲低或过表达IGBP1，检测PP6蛋白水平和泛素化水平，以及PP6与CHIP的相互作用。
评估HES1过表达对银屑病样炎症的缓解作用
验证HES1上调是否能抑制银屑病样皮肤炎症。
通过皮内注射AAV-Hes1在小鼠表皮过表达Hes1，在IMQ诱导下观察皮肤炎症表型和相关蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证靶标相互作用
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 分散酶II | Sigma-Aldrich | D4693 |
| 胰蛋白酶-EDTA | GIBCO | 25300062 | |
| 154CF培养基 | GIBCO | M154CF500 | |
| 人角质形成细胞生长补充剂 | GIBCO | S0015 | |
| DMEM/高糖培养基 | HyClone | SH30022.01 | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| Lifeline Cell Technology基础培养基 | Lifeline Cell Technology | FC-0007 | |
| Lifeline Cell Technology生长因子 | Lifeline Cell Technology | LL-0007 | |
| 药物处理 | 雷西莫特 | -- | -- |
| L-薄荷醇 | Sigma-Aldrich | 224464 | |
| MG132 | -- | -- | |
| 肿瘤坏死因子-α | -- | -- | |
| 白细胞介素-22 | -- | -- | |
| Western blot和免疫沉淀 | Western和IP细胞裂解液 | Beyotime | P0013 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Bimake | B14001 | |
| 免疫沉淀 | 抗PPP6C抗体 | Abcam | 131335 |
| 兔IgG | Abcam | 172730 | |
| 蛋白A/G磁珠 | Merck Millipore | LSKMAGAG02 | |
| Western blot | 抗β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 60008-1-Ig |
| 抗HES1抗体 | Cell Signaling Technology | 11988S | |
| 抗IGBP1抗体 | Abcam | ab170911 | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Proteintech | 66031-1-Ig | |
| 抗CHIP抗体 | Abcam | ab134064 | |
| 抗HA标签抗体 | Proteintech | 66006-2-Ig | |
| 抗SET抗体 | Abcam | 181990 | |
| 抗AURKA抗体 | Abcam | 247643 | |
| 抗泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 3936S | |
| 抗TLR7抗体 | Novus | NBP2-27332 | |
| 抗C/EBP-β抗体 | Abcam | 32358 | |
| 抗磷酸化C/EBP-β (Thr188)抗体 | Cell Signaling Technology | 3084 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Beyotime | A0216 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Beyotime | A0208 | |
| ECL Western blot底物 | Thermo Fisher Scientific | 34095 | |
| Amersham Imager 600 | GE Healthcare | -- | |
| 筛选 | Tsbiochem天然化合物库 | Tsbiochem | L-6000 |
| qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| HiScript II Q RT SuperMix用于qPCR | Vazyme | R22301 | |
| Hieff qPCR SYBR Green预混液 | Yeasen Biotech | 11202ES03 | |
| ViiA 7实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 蛋白质纯化 | pET-28a (+)载体 | -- | -- |
| pSUMO3载体 | -- | -- | |
| 异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷 | -- | -- | |
| 镍亲和层析树脂 | Smart-Lifesciences | SA005C15 | |
| HILOAD 26/60 SUPERDEX 75PG凝胶过滤柱 | GE Healthcare | -- | |
| SENP蛋白酶 | -- | -- | |
| ELISA | 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | NeoBioscience | EMC004.96 |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | NeoBioscience | EMC102a.96 | |
| 小鼠IL-23 ELISA试剂盒 | BioLegend | 433704 | |
| MST | Monolith NT.115 | NanoTemper Technologies | -- |
| Monolith His标签标记试剂盒RED-tris-NTA第二代 | NanoTemper Technologies | MP-L018 | |
| 优质涂层毛细管 | NanoTemper Technologies | MO-K025 | |
| DARTS | Pierce Rapid Gold BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | A53225 |
| 链霉蛋白酶 | Roche | 10165921001 | |
| 5x上样缓冲液 | Servicebio | G2013 | |
| Pierce质谱银染试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 24600 | |
| 质谱 | Agilent 1290高效液相色谱仪 | Agilent | -- |
| Agilent 6545四极杆飞行时间质谱仪 | Agilent | -- | |
| 荧光素酶报告基因 | pGL3-basic载体 | Promega | E1751 |
| pRL-TK海肾荧光素酶载体 | -- | -- | |
| TurboFect转染试剂 | Thermo Scientific | R0531 | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 | |
| 酶标仪（Berthold TriStar LB941） | Berthold | -- | |
| RNA干扰 | 靶向HES1的小干扰RNA | GenePharma | -- |
| 靶向IGBP1的小干扰RNA | GenePharma | -- | |
| scRNA-seq | Chromium单细胞3' v3试剂盒 | 10x Genomics | -- |
| Illumina HiSeq 4000测序平台 | Illumina | -- | |
| 3D皮肤模型 | 3D人皮肤等效模型 | Regenovo | -- |
| Transwell小室 | CORNING | 3493 | |
| CnT-PR-3D培养基 | CELLNTEC | Cnt-PR-3D | |
| 细胞增殖 | MTT试剂 | Beyotime | C0009S |
| Multiskan GO酶标仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 动物实验 | 表达Hes1的腺相关病毒 | Hanbio Biotechnology | -- |
| 对照腺相关病毒（表达GFP） | Hanbio Biotechnology | -- | |
| 咪喹莫特乳膏 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞实验 | HaCaT细胞、NHEK细胞、原代小鼠角质形成细胞的培养条件；L-薄荷醇处理浓度（10 μM）和时间（12小时）；R848浓度（1 μg/ml） 阅读提示：Methods：Cell culture，Screening for PP6-upregulating compounds |
| 动物实验 | 小鼠品系（C57BL/6）、年龄（6-10周）、性别（雄性）；IMQ剂量（25 mg/耳/天）、L-薄荷醇剂量（50 μg/天）、溶剂（乙醇）、给药途径（外用）和持续时间（7天） 阅读提示：Methods：Animal models of psoriasis and treatment |
| 条件敲除小鼠 | Pp6fl/fl和K5.Pp6fl/fl小鼠；Hes1fl/fl和K5.Hes1fl/fl小鼠；Cre重组酶类型（K5-Cre）；遗传背景 阅读提示：Methods：Animals |
| 靶标验证 | HES1与L-薄荷醇结合的Kd值（16.8 nM）；MST实验条件；DARTS实验条件（包括蛋白来源、pronase浓度、处理时间） 阅读提示：Methods：Microscale thermophoresis (MST) assay，Drug affinity responsive target stability assay |
| 机制验证 | IGBP1启动子报告基因序列（野生型和突变型）；转染试剂和浓度；荧光素酶检测时间点（48小时） 阅读提示：Methods：Luciferase reporter assays |