验证E. coli中d-乳酸的产生
确认大肠杆菌是否产生d-乳酸并响应厌氧条件。
将大肠杆菌野生型在厌氧和有氧条件下过夜培养，收集上清液，使用d-乳酸检测试剂盒测定d-乳酸浓度。
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d-乳酸驱动赖氨酸d-乳酸化修饰调控大肠杆菌代谢
d-lactate drives lysine d-lactylation to regulate metabolism in Escherichia coli.
实验完整度
高包含体外酶活测定、体内过表达/敲除验证、蛋白质组学鉴定、合成肽验证、生长表型分析等多个独立证据层级，并明确进行了功能与机制验证。
主要模型
大肠杆菌MG1655野生型菌株 大肠杆菌基因敲除菌株（ΔydiF、ΔldhA、ΔcobB） 大肠杆菌基因过表达菌株（pYdiF、pLdhA、pCobB、pGapA、pGapAK257Q） 人宫颈癌细胞系（HeLa）及乳酸杆菌、奇异变形杆菌等菌株（用于KD-la存在性比较）
重点核对
E. coli MG1655及敲除菌株（ΔydiF、ΔldhA、ΔcobB）的来源与构建 细菌培养条件：LB或M9培养基、温度37°C、转速220 rpm、厌氧/有氧条件 外源d-乳酸钠处理浓度（0、30、60、100 mM）及处理至OD600 0.4-0.5 YdiF酶活体外反应条件：1 mM Acac-CoA、10 mM d-乳酸、35°C、20 min、7.5 μg YdiF GapA K257Q突变体的生长实验：M9培养基中1%葡萄糖或1%甘油作为唯一碳源
摘要
l-乳酸衍生的赖氨酸l-乳酸化修饰（KL-la）已成为多种细胞过程和疾病发病机制中的关键调控因子。乳酸在真核生物中主要以l-异构体存在，而在一些细菌中l-和d-乳酸同时存在。然而，d-乳酸是否能驱动翻译后修饰以发挥生物学功能仍不清楚。在此，我们报道d-乳酸衍生的赖氨酸d-乳酸化修饰（KD-la）在大肠杆菌中作为一种翻译后修饰存在。我们证明乙酸CoA转移酶（YdiF）催化d-乳酸辅酶A（d-lactyl-CoA）的形成，这是关键的d-乳酸基供体，将d-乳酸与KD-la连接起来。值得注意的是，我们在大肠杆菌的71种蛋白质上鉴定了86个KD-la位点。此外，我们的数据表明，厌氧条件增强糖酵解，通过l-乳酸脱氢酶A（LdhA）增加d-乳酸的产生，并进一步提高KD-la水平。我们还发现CobB作为内源性去d-乳酸化酶。我们的实验进一步表明GapA的K257可以调节细菌生长，而CobB可以去除该位点的KD-la，表明CobB介导的KD-la的潜在作用。总之，这项研究表明由d-乳酸直接驱动的KD-la作为一种调控机制存在，并为d-乳酸在原核生物中的功能作用提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- d-乳酸是否能够驱动赖氨酸d-乳酸化修饰（KD-la）并在大肠杆菌中发挥生物学功能，以及其调控机制如何。
- 核心机制
- d-乳酸通过YdiF转化为d-lactyl-CoA作为d-乳酸基供体，驱动KD-la形成；LdhA在厌氧条件下促进d-乳酸生成进而提高KD-la水平；CobB作为内源性去d-乳酸化酶去除KD-la，通过调控GapA K257位点的修饰影响细菌生长。
- 主要证据
- 通过体外酶活实验、过表达/敲除菌株的免疫印迹、蛋白质组学鉴定（86个KD-la位点）及合成肽MS/MS验证，证明YdiF、LdhA、CobB的功能；GapA K257Q突变体生长实验和CobB介导的去修饰实验表明该位点影响细菌生长和GapA活性。
- 研究意义
- 该研究揭示了d-乳酸直接驱动的KD-la作为原核生物中的一种调控机制，为理解d-乳酸在微生物中的功能作用提供了新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测KD-la的存在及外源d-乳酸的影响
探究KD-la是否存在于多种生物中，以及外源d-乳酸是否影响KD-la水平。
使用pan抗KD-la抗体对不同细胞（HeLa、LGG、奇异变形杆菌、大肠杆菌）进行Western blot；用不同浓度d-乳酸钠处理大肠杆菌野生型，检测KD-la水平。
鉴定YdiF的d-lactyl-CoA转移酶活性
验证YdiF是否催化d-乳酸生成d-lactyl-CoA，及其对KD-la水平的影响。
体外反应：纯化的YdiF与d-乳酸和Acac-CoA孵育，通过HPLC-MS/MS检测d-lactyl-CoA；构建YdiF过表达菌株和敲除菌株，通过免疫印迹分析KD-la水平。
蛋白质组学鉴定KD-la位点
系统鉴定大肠杆菌中KD-la修饰的蛋白质和位点。
利用抗KD-la抗体富集大肠杆菌蛋白肽段，进行nano-HPLC-MS/MS分析，并通过合成肽验证修饰。
功能富集与互作网络分析
分析KD-la底物的功能富集与蛋白-蛋白相互作用网络，预测其潜在功能。
对鉴定的KD-la蛋白进行GO和KEGG通路富集分析，并通过STRING和Cytoscape进行蛋白-蛋白互作网络分析。
考察厌氧条件及碳源对KD-la的影响
探究细胞代谢状态（厌氧、不同碳源）如何影响KD-la水平。
将大肠杆菌在厌氧/有氧条件下培养，或在不同碳源的M9培养基中培养，通过免疫印迹分析KD-la水平。
验证LdhA对KD-la的调控作用
验证LdhA是否通过调控d-乳酸产生来影响KD-la水平。
构建过表达ldhA、dld、lldD的菌株以及ΔldhA敲除菌株，通过免疫印迹检测KD-la水平，并测定d-乳酸含量。
验证CobB的去d-乳酸化酶活性
验证CobB是否作为内源性去d-乳酸化酶发挥作用。
比较野生型、ΔcobB、CobB过表达菌株的KD-la水平；体外将CobB与底物蛋白孵育检测去修饰活性；用合成肽验证CobB去除GapA K257D-la。
评估GapA K257D-la对细菌生长的影响
研究GapA K257位点的d-乳酸化修饰是否影响细菌生长和GapA活性。
构建GapA K257Q突变体（模拟d-乳酸化），体外测定酶活性；比较过表达GapA和GapAK257Q的菌株在不同碳源下的生长曲线及细胞内GapA活性；比较野生型和ΔcobB菌株的生长和GapA活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
检测d-乳酸水平
验证蛋白表达与修饰
鉴定酶活性
蛋白质组学鉴定
蛋白互作网络分析
细菌生长表型分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| d-乳酸浓度检测 | d-乳酸检测试剂盒 | Elabscience | -- |
| Western blot | 抗d-乳酸化赖氨酸抗体 | PTM Biolabs Inc. | -- |
| 蛋白质表达与纯化 | HisPur镍-次氮基三乙酸树脂 | -- | -- |
| 蛋白质浓缩 | Amicon Ultra-0.5离心过滤装置 | -- | -- |
| 质谱分析 | Orbitrap Exploris 480质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 液相色谱分离 | ACQUITY BEH C18色谱柱 | Waters | -- |
| 样品脱盐 | SepPak C18小柱 | Waters | -- |
| 样品纯化 | C18 ZipTips | Millipore Corp | -- |
| 质粒构建 | pEASY-Basic无缝克隆和组装试剂盒 | TRANS | -- |
| 点突变 | 快速突变系统 | TRANS | -- |
| 测序级胰蛋白酶 | 测序级胰蛋白酶 | Beijing Shengxia Proteins Scientific Ltd. | -- |
| GapA活性检测 | G3P脱氢酶活性检测试剂盒 | Solarbio | BC2210 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细菌培养和菌株 | 菌株来源：MG1655、BL21(λDE3)、BW25113、ΔydiF、ΔldhA、ΔcobB等；培养条件：LB或M9培养基、温度37°C、转速220 rpm、厌氧/有氧条件、抗生素使用（氨苄青霉素50 μg/ml、卡那霉素50 μg/ml）。 阅读提示：见“Experimental procedures”中的“Strains and reagents”和“Construction of genes overexpressing E. coli strains” |
| d-乳酸浓度检测 | 使用d-Lactate Assay Kit（Elabscience）检测上清液中d-乳酸浓度；样品来自过夜培养的野生型或ΔldhA菌株；厌氧/有氧条件；n=3生物学重复。 阅读提示：见“Experimental procedures”中的“d-lactate concentrations detection”及图1B |
| YdiF酶活体外实验 | 反应体系：50 mM NaH2PO4/Na2HPO4缓冲液（pH 7.0）、5 mM MgCl2、1 mM Acac-CoA、10 mM d-乳酸、7.5 μg纯化YdiF；35°C反应20分钟；产物经C18 ZipTips纯化后HPLC-MS/MS分析。 阅读提示：见“Experimental procedures”中的“In vitro assay for YdiF activity” |
| 蛋白质组学样品制备与KD-la富集 | 使用MG1655菌株在LB培养基过夜培养；蛋白质经TCA沉淀、胰蛋白酶消化（1:50）后，与抗d-乳酸化赖氨酸抗体偶联的琼脂糖珠孵育过夜；洗脱条件包括1%三氟乙酸；最终使用nano-HPLC-MS/MS分析。 阅读提示：见“Experimental procedures”中的“Sample preparation and immunoaffinity enrichment”及“HPLC–MS/MS analysis for KD-la” |
| CobB体外去修饰实验 | 反应体系：10 μg CobB与15 μg纯化Dps或GapA蛋白，在CobB反应缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 8.5, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 mM NAD+）中37°C孵育2小时；免疫印迹检测KD-la水平。 阅读提示：见“Experimental procedures”中的“De-d-lactylation reaction by CobB in vitro” |
| GapA K257D-la肽段去修饰分析 | 合成肽NLTGK(D-la)EADAALGR（50 μM）与CobB（1 μM）在反应缓冲液中37°C孵育2小时；LC-MS/MS分析产物。 阅读提示：见“Experimental procedures”中的“Nano-HPLC assay for determination of the reacted peptides of CobB” |
| 细菌生长曲线 | 菌株在LB培养基过夜培养后，按1:1000稀释于M9培养基（添加1%葡萄糖或1%甘油）中，使用96孔板在37°C培养，每小时测量OD600；每组三个重复孔。 阅读提示：见“Experimental procedures”中的“Drawing a growth curve” |
| GapA活性检测 | 使用G3P Dehydrogenase Activity Assay Kit（Solarbio, BC2210）测定细胞内或重组蛋白的GapA活性。 阅读提示：见“Experimental procedures”中的“Assay for GapA activity” |