CAAR构建与T细胞转导
构建靶向FVIII A2或C1结构域的CAAR-T细胞，并验证其在T细胞表面的表达。
将FVIII A2或C1结构域与CD28跨膜和共刺激域、CD3ζ信号域及P2A-GFP连接，克隆至慢病毒载体，转导激活的人或小鼠T细胞，通过GFP和HA标签检测表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
一种组合性CAAR-T细胞策略在血友病A临床前模型中消除因子VIII抑制物
A combinatorial CAAR-T cell strategy to eliminate factor VIII inhibitors in preclinical models of hemophilia A.
实验完整度
高包含体外细胞毒性、IFN-γ分泌、CD107a脱颗粒、F8KO小鼠模型体内疗效、ELISpot、Bethesda检测、抗体再激发、人源化NCG肿瘤模型及安全性评估等多个证据层级。
主要模型
F8KO血友病A小鼠模型 NCG人源化异种移植肿瘤模型 K562靶细胞系 人原代T细胞
重点核对
F8KO小鼠每周皮下注射重组人FVIII 10 IU共3周诱导抑制物；第0天尾静脉输注CAAR-T细胞 NCG小鼠皮下接种1×10^6 K562靶细胞（BOIIB2和RHD5 1:1混合），第3天和第7天尾静脉输注1×10^7 CAAR-T细胞 效靶比（E:T）为0.3:1、1:1和3:1用于体外杀伤实验 LDH释放法评估细胞毒性，IFN-γ ELISA检测免疫激活 ELISpot和Bethesda法检测抑制物滴度
摘要
嵌合自身抗体受体T（CAAR-T）细胞疗法将CAR-T技术扩展到靶向自身反应性免疫细胞，为治疗自身免疫性疾病提供了一种新方法。在血友病A中，抗因子VIII（FVIII）抑制物的产生构成了主要的临床挑战。本研究探讨了用FVIII C1或A2结构域工程化的CAAR-T细胞消除产生抑制物的B细胞的治疗潜力。体外细胞毒性试验证实，C1和A2 CAAR-T细胞对各自靶标表现出相当的杀伤效率。在F8KO血友病A小鼠模型中，两种CAAR-T细胞均显著降低了循环FVIII抑制物，而它们的组合进一步抑制了FVIII再激发后抑制物的重新出现。在人源化NCG小鼠模型中，组合CAAR-T疗法有效抑制了体内靶细胞扩增。这些发现表明，CAAR-T疗法，特别是组合方法，有望解决血友病A中FVIII抑制物的形成，提供一种靶向且有效的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CAAR-T细胞能否通过靶向FVIII A2和C1结构域来消除产生FVIII抑制物的B细胞，并通过组合疗法增强清除效果并抑制抑制物复发？
- 核心机制
- CAAR-T细胞通过其表面展示的FVIII A2或C1结构域识别并结合抗FVIII B细胞受体（BCR），激活T细胞信号通路，导致靶细胞凋亡，从而清除产生FVIII抑制物的B细胞。
- 主要证据
- 体外细胞毒性实验显示A2和C1 CAAR-T细胞对靶细胞具有显著杀伤活性；F8KO小鼠模型中CAAR-T细胞显著降低血清FVIII抑制物水平，组合治疗进一步降低了再激发后的抑制物水平（Bethesda检测和ELISpot数据支持）；人源化NCG模型中组合CAAR-T有效抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 该研究为针对FVIII抑制物的CAAR-T细胞疗法提供了临床前依据，特别是组合靶向A2和C1结构域的策略可能更全面地应对血友病A患者中异质性抑制物，为未来的临床转化奠定基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外靶细胞模型建立与杀伤验证
验证CAAR-T细胞能否特异性识别并杀伤表达抗FVIII抗体的靶细胞。
将源自BOIIB2（抗A2）和RHD5（抗C1）抗体的scFv插入K562细胞，建立靶细胞系；将CAAR-T细胞与靶细胞共培养，用LDH释放法检测细胞毒性，并检测IFN-γ分泌和CD107a表达。
F8KO小鼠模型评估体内疗效
在血友病A小鼠模型中评估CAAR-T细胞对FVIII抑制物的清除效果及长期作用。
F8KO小鼠皮下免疫重组人FVIII（10 IU/周×3周）建立抑制物模型，第0天尾静脉输注CAAR-T或对照T细胞；通过ELISA、ELISpot和Bethesda检测抑制物水平，并检测脾脏中CAAR-T细胞持久性。
FVIII再激发模型评估组合疗法
评估组合CAAR-T疗法在反复FVIII暴露下对抑制物复发的抑制作用。
F8KO小鼠免疫后输注A2、C1或组合CAAR-T细胞，第14天再次给予rFVIII再激发，第35天检测抑制物水平。
人源化NCG小鼠模型评估组合疗法的体内效果和安全性
在免疫缺陷小鼠中验证人CAAR-T细胞对模拟抑制物产生细胞的体内杀伤作用。
NCG小鼠皮下接种K562靶细胞（BOIIB2和RHD5 1:1混合），第3天和第7天静脉输注人A2和C1组合CAAR-T细胞，测量肿瘤体积和重量，并通过流式检测人T细胞持久性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| T细胞分离与激活 | MojoSort™人CD3 T细胞分选试剂盒 | Biolegend | 480022 |
| 抗人CD3/CD28抗体 | Gibco | 11161D | |
| T细胞培养 | ImmunoCult™-XF T细胞扩增培养基 | STEMCELL | 10981 |
| 慢病毒包装 | HEK 293T细胞 | ATCC | -- |
| pMD2.G质粒 | -- | -- | |
| psPAX2质粒 | -- | -- | |
| 聚乙二醇8000 | -- | -- | |
| 细胞毒性检测 | LDH细胞毒性检测试剂盒（WST） | DOJINDO | CK12 |
| 细胞因子检测 | 人IFN-γ ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-H0108 |
| ELISpot | 小鼠ELISPOT配件试剂盒 | DAKEWE | 2230014 |
| 流式细胞术 | APC抗人CD107a抗体 | Biolegend | 328619 |
| APC抗小鼠CD45.1抗体 | Biolegend | 110713 | |
| Pacific Blue™抗人CD3抗体 | Biolegend | 980004 | |
| 免疫组织化学 | HA标签重组兔单克隆抗体 | Invitrogen | MA5-27915 |
| 流式细胞术 | Pacific Blue™抗小鼠CD44抗体 | Biolegend | 156005 |
| 免疫组织化学 | CD45.1重组单克隆抗体 | Proteintech | 84325-2-RR |
| CD3单克隆抗体 | Invitrogen | 14-0038-82 | |
| 动物免疫 | 重组人凝血因子VIII | SinoCellTech | SCT800 |
| 动物模型 | F8KO小鼠 | Shanghai Modal Organisms | -- |
| NCG小鼠 | Jiangsu GemPharmatech Co., Ltd. | -- | |
| 细胞培养耗材 | 6孔细胞培养板 | NEST | 714011 |
| 12孔细胞培养板 | NEST | 712002 | |
| 96孔细胞培养板 | NEST | 713011 | |
| ELISpot | Multiscreen® 96孔板，亲水性PVDF膜 | MERCK | MSHVS4510 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| F8KO小鼠模型建立 | 小鼠品系、性别、年龄、免疫剂量（10 IU rFVIII）、免疫次数（3次）、佐剂（铝佐剂）、总注射体积（200 μL） 阅读提示：请查阅STAR Methods中Animal models and in vivo CAAR T therapy部分（Hemophilia A mouse model） |
| 体外细胞毒性实验 | 效应细胞与靶细胞比例（E:T）、共培养时间（18小时）、LDH释放试剂盒型号及货号 阅读提示：请查阅STAR Methods中In vitro cytotoxicity assay (LDH release)部分 |
| F8KO小鼠体内疗效评估 | CAAR-T细胞输注剂量、输注途径、检测时间点（第7天、70天等） 阅读提示：请查阅Results中In vivo therapeutic efficacy of CAAR-T cells in the HemA mouse model部分及图2图注 |
| FVIII再激发模型 | 再激发剂量（10 IU）、再激发时间（第14天）、检测时间（第35天）、分组（UTD、A2、C1、组合） 阅读提示：请查阅Results中In vivo therapeutic efficacy...部分及图2E、F图注 |
| 人源化NCG肿瘤模型 | NCG小鼠品系、靶细胞数量（1×10^6）、CAAR-T剂量（5×10^6每种，合计1×10^7）、注射时间（第3天、7天）、肿瘤测量频率（每4天） 阅读提示：请查阅STAR Methods中Tumor xenograft model部分及图4A图注 |