Dhx37表达模式与靶标分析
探究Dhx37在睾丸中的表达分布及其结合的RNA靶标。
对公共单细胞数据（GSE130554和Chen et al.）进行重分析，表征Dhx37在P3.5睾丸中的表达；在TM4细胞中进行RIP-seq，鉴定Dhx37结合的转录本并富集分析。
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多组学分析Dhx37缺陷对睾丸发育和核仁稳态的影响
Multi-omics analysis the effects of Dhx37 deficiency on testis development and nucleolar homeostasis.
实验完整度
高包含RIP-seq、RNAi-RNA-seq、snRNA-seq等多组学分析，结合细胞特异性敲除小鼠模型、免疫荧光、透射电镜及Western blot等体外体内功能验证。
主要模型
TM4小鼠支持细胞系 支持细胞特异性Dhx37敲除小鼠（Dhx37−/−） P60小鼠睾丸单核转录组
重点核对
Dhx37敲低效率：qRT-PCR验证，50 nM siRNA转染TM4细胞，48小时 Dhx37−/−小鼠：Dhx37flox/flox与AMH-Cre杂交，睾丸/体重比及精子计数显著降低 血清睾酮浓度：ELISA检测，8周龄小鼠，Dhx37−/−显著降低 支持细胞增殖与凋亡：KI67和TUNEL荧光定量，Dhx37−/−小鼠增殖减少、凋亡增加 核仁结构：TEM显示Dhx37−/−支持细胞核仁片段化、破裂
摘要
睾丸微环境以支持细胞（Sertoli细胞）为关键组成部分，在精子发生中发挥核心作用。DHX37是DEAH-box RNA解旋酶家族的成员，已被确定为46, XY性发育障碍（DSD）的致病基因，突显其在睾丸发育中的潜在重要性。本研究聚焦于阐明Dhx37在维持支持细胞存活中的作用。RIP-seq和RNAi-RNA-seq揭示Dhx37保护核仁完整性和PI3K–AKT信号，抑制p53驱动的凋亡，其缺失触发促凋亡剪接。随后生成细胞特异性Dhx37敲除小鼠（Dhx37−/−）以研究Dhx37在睾丸发育中的功能。在Dhx37−/−小鼠中，我们观察到显著缺陷，包括睾丸体积减小、睾酮水平降低和生精小管明显空泡化。免疫荧光染色显示支持细胞和生殖细胞区室均受干扰，表现为细胞增殖减少和凋亡增加。snRNA-seq显示调控凋亡和增殖的基因表达发生显著变化，并通过qRT-PCR和Western blot进一步验证。在本研究中，我们确定Dhx37是维持小鼠睾丸支持细胞核仁结构的关键决定因素。核仁的保存有助于维持正常的睾丸形态发生。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Dhx37在睾丸支持细胞中如何维持核仁稳态和细胞存活，其缺失如何导致睾丸发育缺陷？
- 核心机制
- Dhx37缺失导致核仁应激，FBL从核仁转位并结合MDM2，抑制PI3K-Akt信号，激活p53介导的凋亡，破坏血睾屏障，最终导致睾丸萎缩和不育。
- 主要证据
- RIP-seq显示Dhx37结合凋亡、p53和PI3K-Akt通路相关mRNA；RNAi敲低触发促凋亡剪接；Dhx37−/−小鼠显示睾丸减小、睾酮降低、生精小管空泡化、支持细胞和生殖细胞减少、凋亡增加，TEM显示核仁破碎。
- 研究意义
- 本研究建立了第一个睾丸特异性Dhx37敲除动物模型，表明Dhx37是支持细胞核仁结构和功能的关键决定因素，为理解DHX37突变导致的DSD提供了机制基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外Dhx37敲低转录组与剪接分析
评估Dhx37缺失对支持细胞转录组和剪接的影响。
使用siRNA敲低TM4细胞中Dhx37，进行bulk RNA-seq和rMATS分析，鉴定差异表达基因和可变剪接事件。
构建支持细胞特异性Dhx37敲除小鼠
研究Dhx37在体内睾丸发育和精子发生中的作用。
将Dhx37flox/flox小鼠与AMH-Cre小鼠杂交获得Dhx37−/−小鼠，通过Western blot确认敲除效率，观察睾丸形态和生育力。
组织学与类固醇生成分析
评估Dhx37缺失对睾丸结构和激素合成的影响。
通过H&E染色观察生精小管形态，通过IHC检测CYP17A1和STAR表达，通过ELISA检测血清睾酮。
细胞组成与增殖凋亡分析
探究Dhx37缺失对支持细胞和生殖细胞数量及存活的影响。
通过免疫荧光染色检测TRA98、SOX9、KI67、TUNEL，Western blot检测MYH、PLZF、TRA98、WT1、SOX9等标记物。
单核转录组分析
揭示Dhx37缺失对支持细胞基因表达和分化轨迹的影响。
对P60睾丸进行snRNA-seq，鉴定细胞类型，聚焦支持细胞DEGs，并进行RNA velocity分析。
核仁结构超微结构分析
验证Dhx37缺失诱导支持细胞核仁应激。
通过免疫荧光检测FBL，透射电镜观察支持细胞核仁结构。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与转染 | TM4细胞系 | -- | ZQ0091 |
| DMEM/F-12培养基 | -- | -- | |
| Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher | -- | |
| TRIzol试剂 | Invitrogen | -- | |
| RNA-seq | SuperScript II逆转录酶 | Invitrogen | -- |
| 大肠杆菌DNA聚合酶I | NEB | -- | |
| 核糖核酸酶H | NEB | -- | |
| dUTP溶液 | Thermo Fisher | -- | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| 尿嘧啶-DNA糖基化酶 | NEB | M0280 | |
| 核分离 | 核裂解缓冲液 | Sigma | NUC-101 |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche | 5892791001 | |
| RNA酶抑制剂 | Promega | N2615 | |
| RNA酶抑制剂 | Thermo Fisher | AM2696 | |
| 单核RNA-seq | Chromium单细胞3' GEM、文库和凝胶珠试剂盒v3 | 10x Genomics | 1000075 |
| Chromium控制器 | 10x Genomics | -- | |
| ELISA | 睾酮ELISA试剂盒 | Elabscience | E-OSEL-M0003 |
| qRT-PCR | RNA提取试剂盒 | Tiangen | DP431 |
| PrimeScript RT试剂盒（含gDNA Eraser） | Takara | RR047A | |
| 原代支持细胞分离 | IV型胶原酶 | Sigma | C5138 |
| 脱氧核糖核酸酶I | Beyotime | D7073 | |
| I型胶原酶 | MCE | 9001-12-1 | |
| 透明质酸酶 | Yeasen | 20426ES60 | |
| 胰蛋白酶 | Sangon | A003702-0100 | |
| 电镜 | JEM-1400Flash透射电子显微镜 | JEOL | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与Dhx37敲低 | TM4细胞系，siRNA浓度50 nM，转染试剂Lipofectamine RNAiMAX，转染时间48小时，生物学重复3个。 阅读提示：Methods: RNA interference (RNAi)-coupled RNA-seq in TM4 cells |
| 支持细胞特异性敲除小鼠构建 | Dhx37flox/flox小鼠与AMH-Cre小鼠杂交，获得Dhx37−/−小鼠；Western blot确认DHX37蛋白几乎完全缺失。 阅读提示：Methods: Generation of Dhx37 conditional knockout mice |
| 组织学与免疫组化 | 睾丸石蜡切片厚度5μm，抗原修复柠檬酸缓冲液pH6.0，抗体孵育过夜，DAB显色。 阅读提示：Methods: Immunohistochemistry and H&E staining |
| 免疫荧光 | 睾丸组织4% PFA固定，切片厚度3μm，透化0.3% Triton X-100，封闭5% BSA，一抗孵育，DAPI染核。 阅读提示：Methods: Immunofluorescent staining |
| 单核RNA-seq | P60睾丸组织，Nuclei EZ Lysis buffer裂解，8000个核上样，Chromium Single Cell 3'试剂盒v3，测序深度≥20000 reads/核。 阅读提示：Methods: Single-nucleus processing and cDNA library preparation |
| 电镜 | 睾丸组织2.5%戊二醛固定，1%锇酸后固定，1%醋酸铀染色，环氧树脂包埋，超薄切片70nm。 阅读提示：Methods: Electron microscopy |
| 血清睾酮检测 | 8周龄小鼠，眼眶静脉丛采血，使用Elabscience ELISA试剂盒（E-OSEL-M0003）检测。 阅读提示：Methods: Detection of the serum testosterone levels |