临床样本与生信分析
评估CCL24在结直肠癌中的表达及其与临床预后和免疫浸润的关系。
利用TCGA-COAD数据库分析CCL24表达与预后和免疫特征的相关性，并通过84对结直肠癌组织微阵列（TMA）进行IHC验证CCL24表达。
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CCL24招募CCR3+肿瘤相关巨噬细胞通过YAP1激活促进免疫抑制，并作为Gracillin治疗结直肠癌的靶点。
CCL24 recruits CCR3+ TAMs to promote immunosuppression via YAP1 activation and serves as a therapeutic target for Gracillin in colorectal cancer.
实验完整度
高包含细胞系共培养、CRISPR敲除、多种小鼠模型（AOM/DSS、皮下、转移）、TMA、RNA-seq、ChIP-seq、scRNA-seq等多层次验证，明确功能与机制。
主要模型
小鼠结直肠癌AOM/DSS模型 MC38细胞皮下及转移模型 RAW264.7巨噬细胞与MC38细胞共培养体系 HCT116细胞与THP-1衍生巨噬细胞共培养体系
重点核对
CCL24敲除通过CRISPR/Cas9实现，需确认敲除效率。 AOM/DSS模型条件：AOM 10 mg/kg腹腔注射一次，2% DSS饮用7天，共3个周期。 ACl24（CM101）给药：10 μg/kg每周一次尾静脉注射，持续3周。 Gracillin给药剂量：20 mg/kg隔日腹腔注射，或10 mg/kg、20 mg/kg在AOM/DSS模型中。 YAP1功能干预：TRULI (10 μM)、Verteporfin (2 μM)处理浓度。
摘要
背景：CC趋化因子协调细胞间通讯并调节肿瘤微环境。本研究探讨C-C基序趋化因子配体24（CCL24）在结直肠癌（CRC）免疫调节中的作用。方法：通过生物信息学和组织微阵列分析CCL24在CRC中的表达及其临床相关性。在AOM/DSS诱导的小鼠CRC模型中进行了CCL24的基因敲除或抗体介导的抑制。将CCL24敲除（CCL24ko）CRC细胞与巨噬细胞或CD8+ T细胞共培养。将小鼠MC38 CRC细胞（CCL24ko）植入C57BL/6小鼠以产生皮下或转移模型。进行分子对接以识别CCL24的潜在药理学抑制剂。结果：CCL24在CRC组织中高表达，并与T细胞功能障碍和不利的患者生存相关。抑制或敲除CCL24可抑制AOM/DSS诱导的小鼠结直肠肿瘤发生，减少肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的数量，并增加CD8+ T细胞数量。虽然CCL24ko细胞在体外的形态变化最小，但其致瘤能力在免疫活性小鼠中降低，而在免疫缺陷小鼠中未降低。CCL24不直接改变CD8+ T细胞群；相反，CCL24+肿瘤细胞招募CCR3+ TAMs，通过促进Hippo通路关键转录因子YAP1的核转位来促进免疫抑制。Gracillin，一种天然化合物，被鉴定为CCL24抑制剂，并在同种异体移植小鼠中与5-氟尿嘧啶和程序性细胞死亡1单克隆抗体疗法协同作用。结论：CCL24促进CCR3+ TAMs的招募，增强CRC中的免疫抑制性肿瘤微环境。使用如gracillin等药物靶向CCL24代表了一种有前景的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CCL24在结直肠癌免疫调节中的作用及其作为治疗靶点的潜力。
- 核心机制
- CCL24通过其受体CCR3招募CCR3+肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），促进YAP1核转位，从而诱导免疫抑制性TAM极化（表达Arg1、Mrc1等），抑制CD8+ T细胞功能，促进结直肠癌进展。
- 主要证据
- TCGA和TMA分析显示CCL24高表达与不良预后和T细胞功能障碍相关；AOM/DSS模型和皮下模型中抑制或敲除CCL24减少肿瘤负担并增加CD8+ T细胞浸润；共培养、RNA-seq和ChIP-seq揭示CCL24通过CCR3激活YAP1介导TAM免疫抑制；Gracillin直接结合CCL24并抑制其作用，增强抗肿瘤免疫并协同化疗和PD-1抗体治疗。
- 研究意义
- 靶向CCL24（如使用Gracillin）可能是一种治疗结直肠癌的有前景的策略，通过逆转免疫抑制性肿瘤微环境来增强抗肿瘤免疫。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞实验
验证CCL24对肿瘤细胞增殖、侵袭及巨噬细胞招募和极化的影响。
使用CRISPR/Cas9构建CCL24敲除的HCT116和MC38细胞系，进行集落形成和Transwell侵袭实验；将肿瘤细胞与巨噬细胞（RAW264.7或THP-1来源）共培养，检测巨噬细胞极化标志物。
体内动物模型验证
验证CCL24在结直肠癌发生和进展中的作用。
利用AOM/DSS诱导的原发性CRC模型、MC38皮下移植瘤模型和尾静脉转移模型，通过抗CCL24抗体或基因敲除干预，评估肿瘤负担和免疫细胞浸润。
机制研究（Hippo/YAP1通路）
阐明CCL24调控TAM免疫抑制的分子机制。
通过RNA-seq、GSEA、核质分离、免疫荧光、qPCR、ChIP-seq和ChIP-qPCR分析YAP1的定位和转录活性，并利用TRULI或siYAP1进行功能获得/丧失实验。
Gracillin靶点验证及联合治疗
验证Gracillin作为CCL24抑制剂的潜力及其与现有疗法联合的抗肿瘤效果。
通过分子对接和表面等离子体共振（SPR）验证Gracillin与CCL24的直接结合；在体内评估Gracillin单药及与5-FU或PD-1抗体联合的抗肿瘤效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 胰蛋白酶 | Gibco | -- | |
| 细胞诱导分化 | PMA（佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯） | Sigma-Aldrich | -- |
| 基因敲除 | lentiCRISPR v2载体 | Addgene | #52961 |
| 细胞增殖实验 | 结晶紫 | -- | -- |
| 侵袭实验 | 基质胶 | Corning | -- |
| 趋化实验 | SB 328437（CCR3拮抗剂） | MedChemExpress | -- |
| 细胞因子检测 | ELISA试剂盒 | Elabscience Biotechnology | -- |
| ELISA试剂盒 | BioLegend | -- | |
| 一氧化氮检测 | Griess试剂盒 | Beyotime | -- |
| ROS检测 | DCFH-DA探针 | -- | -- |
| T细胞分离 | CD8a微珠 | Miltenyi Biotec | -- |
| T细胞激活 | CD3/CD28激动剂抗体 | BioLegend | -- |
| T细胞增殖 | CFSE染料 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 流式分析 | BD LSRFortessa流式细胞仪 | BD | -- |
| FlowJo软件 | -- | -- | |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI双染试剂盒 | BioLegend | -- |
| 核质分离 | NE-PER核和胞质提取试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| 免疫荧光 | YAP1抗体 | Cell Signaling Technology | -- |
| Alexa Fluor 488标记二抗 | -- | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| 共聚焦显微镜（Leica SP8） | Leica | -- | |
| qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| HiScript III RT SuperMix（qPCR用） | Vazyme | -- | |
| ChamQ SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- | |
| ABI 7500系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 分子对接 | AutoDock Vina | -- | -- |
| PyMOL | -- | -- | |
| AOM/DSS模型 | 氧化偶氮甲烷 | Sigma | -- |
| 葡聚糖硫酸钠 | MP Biomedicals | -- | |
| 体内干预 | 抗CCL24中和抗体（CM101） | MedChemExpress | -- |
| 抗CD8α抗体 | BioXcell | BE0004-1 | |
| 细胞系构建 | MC38细胞 | ViCell Biotechnologies | -- |
| HCT116细胞 | ViCell Biotechnologies | -- | |
| Lovo细胞 | ViCell Biotechnologies | -- | |
| SW480细胞 | ViCell Biotechnologies | -- | |
| FHC细胞 | ScienCell Research Laboratories | -- | |
| THP-1细胞 | ViCell | -- | |
| 动物实验 | C57BL/6小鼠 | Anburui Biotechnologies | -- |
| BALB/c裸鼠 | -- | -- | |
| Villin-Cre小鼠 | Jackson Laboratory | -- | |
| 动物模型 | CCL24fl/fl小鼠 | Cyagen Biosciences | -- |
| 体内治疗 | 纤细薯蓣皂苷 | -- | -- |
| 5-氟尿嘧啶 | -- | -- | |
| PD-1单克隆抗体 | BioXcell | BE0146 | |
| 体内成像 | IVIS Lumina III小动物活体成像系统 | PerkinElmer | -- |
| 组织学分析 | 抗Cleaved-Caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | -- |
| 抗CCR3抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| DAB检测系统 | ZSGB-BIO | -- | |
| ChIP | ChIP试剂盒 | Millipore | -- |
| ChIP-seq | YAP1抗体 | Cell Signaling Technology | -- |
| YAP1功能干预 | TRULI（LATS1抑制剂） | MedChemExpress | -- |
| 维替泊芬 | -- | -- | |
| 流式分析 | 抗F4/80、Arg1、Mrc1抗体 | BioLegend | -- |
| SPR | Biacore T200系统 | GE Healthcare | -- |
| CM5传感芯片 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源；培养基类型（DMEM或RPMI-1640）；FBS浓度；抗生素浓度；培养温度及CO2浓度；细胞传代比例；支原体检测情况。 阅读提示：Materials and Methods: Cells and culture |
| CCL24敲除细胞构建 | sgRNA序列；慢病毒包装系统；嘌呤霉素筛选浓度和时间；敲除验证方法。 阅读提示：Materials and Methods: CCL24 knockout cell construction |
| 体外功能实验 | 细胞接种密度；培养时间；集落形成定义（直径>1 mm）；Transwell侵袭实验条件（基质胶、时间）。 阅读提示：Materials and Methods: In vitro cell proliferation and invasion assays |
| 巨噬细胞趋化实验 | 趋化因子浓度（100 ng/mL）；条件培养基制备；CCR3拮抗剂浓度和预处理时间；中和抗体浓度；迁移时间和计数方法。 阅读提示：Materials and Methods: Macrophage chemotaxis assays |
| T细胞功能实验 | T细胞分离方法；CD3/CD28激活浓度；效应细胞与靶细胞比例；共培养时间；CFSE浓度。 阅读提示：Materials and Methods: T cell function and proliferation detection, T cell cytotoxicity analysis |
| AOM/DSS模型 | AOM剂量（10 mg/kg）；注射体积和途径；DSS浓度（2%）；DSS循环次数；动物周龄和性别；随机分组；监测指标。 阅读提示：Materials and Methods: Azoxymethane (AOM)/dextran sulfate sodium (DSS) stimulation |
| 体内抗体干预 | ACl24给药剂量（10 μg/kg）、频率（每周一次）和途径（尾静脉）；抗CD8α抗体剂量（200 μg/鼠）和频率（每5天一次）。 阅读提示：Materials and Methods: In vivo intervention with CCL24 and CD8 neutralizing antibodies |
| 皮下肿瘤模型 | 细胞数量（1×10^6）；注射体积（100 μL）；注射部位；肿瘤体积测量公式；实验终点（4周）。 阅读提示：Materials and Methods: Subcutaneous tumor and metastasis model establishment |
| 转移模型 | 细胞数量（1×10^6）；注射途径（尾静脉）；治疗开始时间（第3天）；PD-1 mAb剂量（200 μg）和频率（每3天）；Gracillin剂量（20 mg/kg）；治疗持续时间（2周）；终点（第21天）。 阅读提示：Materials and Methods: Subcutaneous tumor and metastasis model establishment |
| Gracillin联合治疗 | 皮下模型：Gracillin剂量（20 mg/kg）、给药途径（腹腔）和频率（隔日）；5-FU剂量（30 mg/kg）、途径（腹腔）和频率（每周两次）；治疗持续时间（10天）。 阅读提示：Materials and Methods: Subcutaneous tumor and metastasis model establishment |
| YAP1功能干预 | TRULI浓度（10 μM）；处理时间（48小时）；siRNA转染条件；Verteporfin浓度（2 μM）。 阅读提示：Materials and Methods: YAP1 functional intervention experiments, YAP1 modulation and T cell functional assays |
| 分子对接 | 蛋白质结构来源（AlphaFold AF-Q9NPB8）；小分子结构来源（PubChem CID 124423）；对接网格设置。 阅读提示：Materials and Methods: Molecular docking analysis |