临床样本和数据库分析
评估ATGL在AML患者中的表达及其与预后的关联。
使用转录组测序和TCGA数据库分析ATGL表达，结合119例AML患者临床数据进行预后分析。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
ATGL通过调节CEBPα/SCD1轴抑制急性髓系白血病细胞铁死亡并诱导吉瑞替尼耐药
ATGL suppresses ferroptosis in acute myeloid leukemia cells by modulating the CEBPα/SCD1 axis and induces gilteritinib resistance.
实验完整度
高包含体外细胞实验（敲低/过表达、药物处理）、体内异种移植模型、患者样本分析及转录组测序等多层级验证。
主要模型
MOLM-13细胞系 MV4-11细胞系 患者来源异种移植（PDX）模型 吉瑞替尼耐药MOLM-13/MV4-11细胞系
重点核对
ATGL敲低用shRNA序列（补充表S1）及验证效率 ATGL抑制剂Atglistatin浓度（体外60μM，体内30mg/kg） 吉瑞替尼浓度（体外170nM，体内10mg/kg） Erastin浓度（体外5μM，体内15mg/kg） NSG小鼠周龄和体重（4-5周，11-12g）及肿瘤细胞注射量（5×10^6）
摘要
代谢重编程破坏能量稳态并促进肿瘤细胞增殖。在本研究中，脂肪甘油三酯脂肪酶（ATGL）在急性髓系白血病（AML）患者中的高表达预示不良临床预后。此外，通过基因敲除、过表达和药理学抑制ATGL，证实了ATGL的异常上调促进AML的恶性进展，尤其是在FLT3-ITD突变的AML中。通过RNA测序、脂质过氧化、细胞铁和ROS检测，证实了ATGL与铁死亡的相关性。机制上，ATGL与硬脂酰辅酶A去饱和酶1（SCD1）正相关，并通过CEBPα/SCD1轴抑制铁死亡从而促进AML的恶性进展。我们建立了吉瑞替尼耐药的MOLM-13和MV4-11细胞系，并收集了FLT3-ITD突变患者的细胞，以证实ATGL抑制剂增加了吉瑞替尼的疗效。因此，我们使用来自FLT3-ITD突变AML患者的细胞构建了AML异种移植模型，以在体内证实ATGL抑制剂与吉瑞替尼联合用药的疗效。这项研究为AML提供了新的治疗靶点和监测指标，并为FLT3-ITD突变AML患者以及复发/难治性FLT3-ITD突变AML患者提供了新的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ATGL在AML中的表达和功能如何？其调控铁死亡的机制是什么？靶向ATGL能否提高FLT3-ITD突变AML对吉瑞替尼的敏感性？
- 核心机制
- ATGL通过上调CEBPα进而促进SCD1转录，抑制AML细胞铁死亡，从而促进AML恶性进展并导致吉瑞替尼耐药。
- 主要证据
- 基因敲低/过表达及药理学抑制实验表明ATGL促进AML增殖、抑制凋亡；RNA-seq和脂质过氧化、ROS、铁离子检测证实ATGL抑制铁死亡，并通过CEBPα/SCD1轴调控；PDX模型证实联合用药在体内增强疗效。
- 研究意义
- 为AML提供新的治疗靶点和监测指标，为FLT3-ITD突变及复发/难治性FLT3-ITD突变AML提供新的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外功能实验
验证ATGL对AML细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。
在MOLM-13和MV4-11细胞中敲低和过表达ATGL，检测增殖（CCK8）、凋亡（流式）、细胞周期及凋亡相关蛋白表达。
体内异种移植模型
验证ATGL对AML肿瘤生长和生存的影响。
使用稳定敲低或过表达ATGL的MV4-11细胞注射NSG小鼠，评估肿瘤负荷、脾脏和肝脏病理及生存时间。
机制探索
探究ATGL调控铁死亡的机制。
对ATGL敲低的MV4-11细胞进行RNA-seq，鉴定SCD1为下游靶点，并通过RT-qPCR和Western blot验证ATGL对SCD1和CEBPα的调控；检测ROS、铁离子和脂质过氧化水平。
铁死亡表型验证
验证ATGL抑制剂、SCD1抑制剂、铁死亡激活剂和抑制剂对AML细胞铁死亡的影响。
用Atglistatin、CAY10566、Erastin和Ferrostatin-1处理细胞，检测细胞活力、ROS、铁离子和脂质过氧化。
耐药联合药效评估
评估ATGL抑制剂与吉瑞替尼联合治疗在耐药细胞及患者样本中的效果。
建立吉瑞替尼耐药细胞系，检测ATGL和SCD1表达，计算IC50和联合指数，评估单药和联合用药对细胞增殖、凋亡、铁死亡的影响。
体内联合治疗效果验证
验证ATGL抑制剂与吉瑞替尼联合在PDX模型中的体内疗效。
使用患者来源的FLT3-ITD突变AML细胞构建PDX模型，比较不同治疗组的肿瘤负荷、生存时间和免疫组化分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| β-巯基乙醇 | -- | -- | |
| 原代细胞培养 | ITS溶液 | Sigma-Aldrich | -- |
| 病毒转染 | 慢病毒载体 | Shenggong | -- |
| shRNA序列 | Tsingke Company | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| cDNA合成 | SuperScript™ VILO™ cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| RT-qPCR | SYBR Premix Ex Taq™ (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | -- |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | Promega | G4000 |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Elabscience Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| 细胞周期检测 | 细胞周期分析试剂盒 | Sigma | -- |
| PUFA检测 | 多不饱和脂肪酸ELISA试剂盒 | JingMei Biotechnology | -- |
| MUFA检测 | 单不饱和脂肪酸ELISA试剂盒 | JingMei Biotechnology | -- |
| ATP检测 | ATP检测试剂盒 | Beyotime | S0026 |
| 药物协同效应 | Atglistatin | -- | -- |
| 吉瑞替尼 | -- | -- | |
| Erastin | -- | -- | |
| 数据读取 | 多功能读板机 | Molecular Devices | -- |
| ROS检测 | OxiSelect™细胞内ROS检测试剂盒 | -- | -- |
| 铁离子检测 | 铁离子检测试剂盒 | Scien Cell | -- |
| 脂质过氧化检测 | C11-BODIPY581/591荧光探针 | Thermo Fisher | -- |
| 流式细胞术 | BD LSRII流式细胞仪 | Becton Dickinson | -- |
| CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| Pierce ECL Western印迹底物 | Pierce | -- | |
| Western blot成像 | ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- |
| Western blot | ATGL抗体 | Affinity | DF7277 |
| SCD1抗体 | Affinity | DF13253 | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | HRP-60004 | |
| Cleaved Caspase-3抗体 | Affinity | BF0711 | |
| Bax抗体 | Affinity | AF0120 | |
| Bcl-2抗体 | Affinity | AF6139 | |
| CEBPα抗体 | Affinity | AF6333 | |
| 动物实验 | NSG小鼠 | Vital River | -- |
| 体内治疗 | Atglistatin | -- | -- |
| 吉瑞替尼 | -- | -- | |
| Erastin | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞培养基（RPMI-1640）、血清浓度（10% FBS）、抗生素（青霉素/链霉素）、THP-1需额外添加0.05mM β-巯基乙醇；培养条件37°C、5% CO2。 阅读提示：Materials and methods: AML-patients samples, cell lines, and culture |
| 基因敲低/过表达 | shRNA序列（补充表S1）、慢病毒载体构建和感染效率；puromycin筛选浓度。 阅读提示：Materials and methods: Virus infection; Supplementary Table S1 |
| 体外药物处理 | Atglistatin（60μM）、Gilteritinib（170nM）、Erastin（5μM）处理时间24小时；细胞接种密度（约5000细胞/孔）及培养条件。 阅读提示：Materials and methods: Synegistic effect in vitro cell assay; Results: Fig.6 legend |
| 铁死亡检测 | ROS检测试剂盒（OxiSelect）、铁离子检测试剂盒（Scien Cell）、C11-BODIPY581/591探针浓度（2.0μM）及孵育时间（30分钟）和温度（37°C）。 阅读提示：Materials and methods: ROS assay, iron assay; Lipid peroxidation |
| 体内动物模型 | NSG小鼠周龄（4-5周）和体重（11-12g）、细胞注射数量（5×10^6）、给药剂量和途径（Atglistatin 30mg/kg po, Gilteritinib 10mg/kg po, Erastin 15mg/kg iv）、治疗开始时间（第7天）和持续时间（28天）。 阅读提示：Materials and methods: AML xenograft model; Fig.8 legend |
| 统计分析 | 所有实验三次重复（除注明外）；两组间比较用双尾Student's t检验；p < 0.05为显著；使用GraphPad Prism 9.0。 阅读提示：Materials and methods: Quantification and statistical analysis |