比较EB和iTF微胶质细胞的基本特征
验证两种方案产生的iMGL是否具有小胶质细胞特征，并评估其脂滴负荷差异。
通过免疫细胞化学检测IBA1表达，qRT-PCR检测标志基因（CSF1R、CX3CR1、P2RY12、LYVE1、TMEM119等），并使用PLIN2免疫染色和Western blot评估脂滴负荷。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
iPSC衍生小胶质细胞方案的比较脂质组学揭示由培养基成分介导的脂滴和免疫差异
Comparative lipidomics of iPSC-derived microglia protocols reveal lipid droplet and immune differences mediated by media composition.
实验完整度
高包含脂质组学、Western blot、流式细胞术、免疫细胞化学等多层级实验，并进行了培养基补充剂替换和机制验证。
主要模型
EB微胶质细胞（WTC11和KOLF2.1J） iTF微胶质细胞（WTC11和KOLF2.1J）
重点核对
iMGL分化方案（EB vs iTF） 培养基成分（B-27补充剂、L-肉碱） 脂质组学检测（TG、DG、FA等脂类） 小胶质细胞状态标记物（P2RY12、LGALS3等） LPS刺激反应
摘要
Van der Kant及其同事发现，iPSC衍生的小胶质细胞的脂质组受到分化方案和培养基补充剂选择的强烈影响。作者表明，B-27补充剂，特别是B-27中存在的左旋肉碱，降低了甘油三酯中的脂肪酸储存，从而减少了脂滴含量并诱导了更稳态的小胶质细胞状态。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 两种iPSC衍生小胶质细胞方案（EB和iTF）产生的细胞在脂质代谢和免疫状态上是否存在差异，以及这些差异的机制是什么？
- 核心机制
- B-27补充剂中的L-肉碱通过促进脂肪酸线粒体β氧化，减少甘油三酯储存和脂滴积累，从而诱导更稳态的小胶质细胞状态。
- 主要证据
- 脂质组学显示iTF微胶质细胞TG和DG水平升高，添加B-27或L-肉碱后降低；流式细胞术显示B-27降低炎症标记物并增加稳态标记物；LPS实验表明B-27补充使细胞能响应免疫刺激。
- 研究意义
- 研究强调iMGL分化方法和培养基补充剂对脂质代谢的影响，对模拟阿尔茨海默病和神经炎症过程具有重要意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
脂质组学分析EB和iTF微胶质细胞
系统比较两种iMGL的脂质组成，确定差异脂类。
对EB和iTF微胶质细胞进行定量脂质组学分析，检测1009种脂质，涵盖16个脂类。
培养基切换实验验证培养基对甘油三酯的影响
确定iTF微胶质细胞中甘油三酯升高是由诱导方法还是培养基成分导致。
将EB微胶质细胞在iTF培养基中成熟（EB-iTF），进行脂质组学分析，并检测PLIN2表达。
鉴定B-27补充剂对甘油三酯积累的调节作用
测试培养基中不同成分（如B-27）对甘油三酯水平的影响。
在EB培养基中移除B-27或在iTF培养基中添加B-27，检测脂质组和PLIN2表达。
评估B-27对小胶质细胞免疫状态的影响
确定B-27补充是否改变iTF微胶质细胞的免疫表型。
使用流式细胞术检测炎症和稳态标记物（CCL13、SPP1、CD9、LGALS3、CXCL10、IFIT1、P2RY12），并用LPS刺激检测脂滴反应。
验证L-肉碱对脂质组和免疫状态的影响
测试B-27中的L-肉碱是否能模拟B-27的效果。
在iTF培养基中添加L-肉碱，进行脂质组学分析和免疫状态标记物检测。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Essential 8 培养基 | Gibco | A1517001 |
| Geltrex 基质胶 | Fisher Scientific | A1413302 | |
| StemPro Accutase 细胞解离试剂 | Gibco | A1110501 | |
| Advanced DMEM/F-12 培养基 | Gibco | 12634028 | |
| B-27 补充剂 | Gibco | 17504044 | |
| 左旋肉碱盐酸盐 | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| 多西环素 | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| 重组人IL-34 | Peprotech | 200-34 | |
| 重组人M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| 重组人GM-CSF | Peprotech | 300-03 | |
| 重组人TGFβ1 | Peprotech | 100-21C | |
| 重组人SCF | Peprotech | 300-07 | |
| 重组人BMP4 | Peprotech | AF-120-05ET | |
| 重组人VEGF | Peprotech | 100-20 | |
| X-VIVO 15 无血清造血细胞培养基 | Lonza | 02-060Q | |
| Neurobasal 培养基 | Gibco | 21103049 | |
| Albumax II 富脂牛血清白蛋白 | Gibco | 11021029 | |
| KnockOut 血清替代物 | Gibco | 10828028 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| 脂质组学 | ISOLATE II RNA 微量提取试剂盒 | Meridian Bioscience | BIO-52073 |
| Pierce TCEP-HCl | Thermo Scientific | 20491 | |
| 基因表达分析 | SensiFast cDNA 合成试剂盒 | Meridian Bioscience | BIO-65054 |
| SensiFast SYBR Lo-ROX 试剂盒 | Meridian Bioscience | BIO-94020 | |
| QuantStudio 5 实时荧光定量PCR仪 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 免疫细胞化学 | Triton X-100 | Fisher Chemical | 10254640 |
| 正常山羊血清 | Gibco | 11540526 | |
| 牛血清白蛋白 | Roche | 10735086001 | |
| 抗perilipin 2抗体 | Proteintech | 15294-1-AP | |
| 抗Iba1抗体 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 019-19741 | |
| DAPI | Carl Roth | 6843.1 | |
| 鬼笔环肽iFluor 647试剂 | Abcam | ab176759 | |
| CellInsight CX7 LED Pro 高内涵筛选平台 | Fisher Scientific | -- | |
| Nikon Ti-Eclipse 显微镜 | Nikon | -- | |
| Western blot | Criterion TGX Stain-free 凝胶 | BIO-RAD | 5678085 |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi 0.45 μm LF PVDF 转印试剂盒 | BIO-RAD | 1704275 | |
| Trans-blot Turbo 转印系统 | BIO-RAD | 1704150 | |
| GAPDH抗体 | elabscience | E-AB40337 | |
| ACTIN抗体 | Sigma-Aldrich | MAB1501 | |
| 多克隆HRP二抗 | Agilent | P044801 | |
| IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | |
| IRDye 680RD | LI-COR | 926-68071 | |
| LI-COR Odyssey Fc 成像系统 | LI-COR | -- | |
| 流式细胞术 | TrypLE Express 酶 | Gibco | 12605-028 |
| CD9抗体 | BioLegend | 312104 | |
| P2RY12抗体 | BioLegend | 392108 | |
| LGALS3抗体 | BioLegend | 125410 | |
| Fc受体阻断剂 | BioLegend | 422302 | |
| eBioscience 细胞内固定和透化缓冲液套装 | Invitrogen | 88-8824-00 | |
| IFIT1抗体 | Cell Signaling | 20329S | |
| CXCL10抗体 | BioLegend | 519504 | |
| SPP1抗体 | eBioscience | 50-9096-42 | |
| CCL13抗体 | R&D systems | IC327G | |
| BD LSR Fortessa X14 流式细胞仪 | BD | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| iMGL分化 | 分化方案（EB或iTF）、细胞系（WTC11或KOLF2.1J）、培养基成分（B-27、L-肉碱） 阅读提示：Methods中“Human induced pluripotent stem cell-derived microglia culture and differentiation”部分 |
| 脂质组学分析 | 细胞数量（0.5-1.5百万）、样本制备方法、脂质提取和检测平台 阅读提示：Methods中“Lipidomic analysis”部分 |
| 免疫表型检测 | 抗体浓度、流式细胞仪设置、门控策略 阅读提示：Methods中“Flow cytometry”部分 |
| LPS刺激实验 | LPS浓度（文中未明确说明）、处理时间（24小时）、培养基条件（-B-27或+B-27） 阅读提示：Methods中“Human induced pluripotent stem cell-derived microglia culture and differentiation (induced transcription factor protocol)”部分 |