验证铁死亡过程中铁蛋白水平与铁离子变化
探究铁死亡时细胞内铁的来源。
检测多种癌细胞系在erastin处理后铁蛋白（FTH1、FTL）及总铁、二价铁的水平。
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AAK1激活介导的铁转运驱动铁死亡细胞死亡
AAK1 activation-mediated iron trafficking drives ferroptotic cell death.
实验完整度
高包含体外细胞实验、磷酸化位点突变、体内异种移植模型、临床样本免疫组化及公共数据库分析，并进行功能验证和机制验证。
主要模型
MDA-MB-231乳腺癌细胞 HT1080纤维肉瘤细胞 BALB/c裸鼠异种移植模型 乳腺癌患者组织样本
重点核对
细胞系：MDA-MB-231和HT1080 铁死亡诱导剂：erastin浓度（MDA-MB-231 2 μM，HT1080 1 μM）及处理时间12小时 PKCβ、AAK1、AP2M1的敲除或突变 内吞抑制剂dynasore处理条件 体内IKE给药剂量（40 mg/kg）
摘要
亚铁离子是铁死亡发生的必要条件。维持细胞内铁稳态的分子机制在铁死亡的调控中起着至关重要的作用。然而，在铁死亡过程中，细胞如何调控铁摄取仍不清楚。在此，PKCβII被鉴定为一种关键激酶，通过磷酸化并激活AP2相关蛋白激酶1（AAK1）来介导转铁蛋白受体1（TFR1）的内吞，从而在铁死亡过程中发挥作用。机制上，激活的AAK1磷酸化AP2M1，促进网格蛋白的招募以介导TFR1的内吞，增加细胞总铁和亚铁离子的水平，从而促进铁死亡。AAK1的不可磷酸化突变抑制铁死亡，进而在体内促进乳腺肿瘤生长。总之，我们鉴定出PKCβII-AAK1-AP2M1通路是铁死亡过程中调控细胞铁摄取的关键机制，该通路与乳腺癌患者的预后相关，并可能成为癌症治疗的潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在铁死亡过程中，细胞如何调控铁摄取，以及TFR1内吞的分子机制是什么？
- 核心机制
- PKCβII直接磷酸化AAK1的S670/T674位点，激活AAK1，进而促进AP2M1的磷酸化，增强网格蛋白介导的TFR1内吞，增加细胞内总铁和亚铁水平，从而促进铁死亡。
- 主要证据
- 通过磷酸化蛋白质组学鉴定AAK1为PKCβII下游，体外激酶实验证实直接磷酸化，突变实验验证S670/T674位点对TFR1内吞和铁死亡的必要性，体内异种移植模型证明AAK1缺失抑制铁死亡并促进肿瘤生长。
- 研究意义
- 揭示PKCβII-AAK1-AP2M1通路是铁死亡过程中细胞铁摄取的关键机制，与乳腺癌预后相关，为癌症治疗提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测TFR1内吞在铁死亡中的变化
确定TFR1内吞是否在铁死亡中被增强。
使用TFR1抗体标记表面受体，在37°C允许内吞，通过流式细胞术检测内吞水平，并使用dynasore抑制内吞。
验证PKCβII对TFR1内吞和铁水平的调控
确定PKCβII是否调控TFR1内吞及铁摄取。
在PKCβ敲除细胞中回补PKCβI或PKCβII，检测TFR1内吞和铁水平。
鉴定PKCβII下游激酶AAK1及其相互作用
寻找介导PKCβII调控TFR1内吞的关键激酶。
通过磷酸化蛋白质组学分析PKCβ敲除细胞中磷酸化水平变化，并通过免疫共沉淀验证PKCβII与AAK1的相互作用。
验证AAK1磷酸化位点及功能
确定PKCβII磷酸化AAK1的具体位点及其对TFR1内吞和铁死亡的作用。
构建AAK1突变体（S670/T674A或E），检测TFR1内吞和铁死亡敏感性。
验证AP2M1在通路中的作用
确认AAK1下游AP2M1磷酸化对TFR1内吞和铁死亡的必要性。
在AP2M1敲除细胞中回补野生型或T156突变体，检测TFR1内吞和铁死亡。
评估AAK1对铁死亡敏感性的影响
确定AAK1是否作为铁死亡的促进因子。
通过siRNA或敲除AAK1，检测erastin或胱氨酸 deprivation诱导的铁死亡和脂质过氧化。
体内验证AAK1对肿瘤生长和铁死亡的影响
评估AAK1在体内对铁死亡和肿瘤生长的影响。
将AAK1敲除或对照细胞接种裸鼠，用IKE或BSO处理，测量肿瘤体积和重量，并检测脂质过氧化标志物。
临床相关性分析
评估PKCβII-AAK1-AP2M1通路与乳腺癌预后的关系。
利用TCGA和ICGC-BC数据库分析AAK1表达与生存期及与抗铁死亡基因集的相关性；使用组织芯片进行免疫组化检测PKCβII、p-AAK1和4-HNE。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | GIBCO? | -- |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 药物处理 | Go6983 | Selleck | S2911 |
| 恩扎妥林 | Selleck | S1055 | |
| SGC-AAK1-1 | Sigma-Aldrich | SML2219 | |
| 爱拉斯汀 | TargetMol | T1765 | |
| Ferrostatin-1 | Selleck | S7243 | |
| 去铁胺 | Selleck | S5742 | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Selleck | S1623 | |
| Z-VAD-FMK | Selleck | S7023 | |
| 坏死抑素-1 | Selleck | S8037 | |
| 细胞培养 | 无胱氨酸DMEM培养基 | GIBCO | 21013024 |
| 质粒构建 | pCDH-Neo载体 | -- | -- |
| PGEX-6P-1载体 | -- | -- | |
| pcDNA3.1载体 | -- | -- | |
| 基因敲除 | Lenti-Crispr-V2载体 | -- | -- |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| siRNA转染 | RNAmate转染试剂 | -- | -- |
| RNA提取 | RNA纯化试剂盒 | EZBioscience | B0004D |
| 逆转录 | miRNA第一链cDNA合成试剂盒 | Vazyme | MR201-01 |
| 实时荧光定量PCR | ChamQ SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q311-03 |
| 细胞死亡检测 | 碘化丙啶 | MPbio | 0219545810 |
| 脂质过氧化检测 | BODIPY 581/591 C11 | Invitrogen | D3861 |
| 内吞检测 | TrypLE Express消化液 | GIBCO | 12605010 |
| TFR1特异性抗体 | Proteintech | 66180-1-Ig | |
| dynasore | TargetMol | T1848 | |
| Alexa Fluor-488标记的抗小鼠二抗 | Invitrogen | A11029 | |
| 铁水平检测 | 细胞总铁比色检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K880-M-96T |
| 细胞亚铁比色检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K881-M-96T | |
| 免疫荧光 | FerroOrange | DOJINDO | F374-3tubes |
| TritonX-100 | MP Biomedicals | 219485480 | |
| 抗AAK1抗体 | CST | 79832 | |
| 抗Flag抗体 | CST | 14793S | |
| Hoechst 33342 | Beyotime | C1022 | |
| 荧光显微镜（ZEISS LSM880，带fast Airyscan） | ZEISS | LSM880 | |
| 体外激酶实验 | GST珠子 | Beyotime | P2138 |
| 人重组活化PKCβII激酶 | Abcam | ab60841 | |
| 激酶缓冲液 | CST | 9802S | |
| ATP | CST | 9804S | |
| λ磷酸酶 | -- | -- | |
| 免疫印迹 | Pierce蛋白A/G琼脂糖珠 | MCE | HY-K0202 |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| TFR1抗体 | Proteintech | 66180-1-Ig | |
| FTH1抗体 | HUABIO | ET1705-55 | |
| FTL抗体 | HUABIO | EM1707-17 | |
| DMT1抗体 | HUABIO | ER1907-55 | |
| FPN1抗体 | HUABIO | HA601178 | |
| PKCβ抗体 | Proteintech | 12919-1-AP | |
| PKCβⅠ抗体 | Santa Cruz | sc-8049 | |
| PKCβII抗体 | Santa Cruz | sc-13149 | |
| AAK1抗体 | CST | 79832T | |
| AP2M1抗体 | Abclonal | A11070 | |
| Flag抗体 | Abcepta | AP1013A | |
| 磷酸化丝氨酸/苏氨酸抗体 | Abcam | ab17464 | |
| 磷酸化AP2M1(Thr156)抗体 | Abcam | ab109397 | |
| 动物实验 | IKE | -- | -- |
| BSO | -- | -- | |
| Lipro-1 | -- | -- | |
| 免疫组织化学 | 数字病理切片扫描仪 | KFBIO | KF-PRO-020 |
| HALO软件 | lndica Labs | 3.6.4134 | |
| 磷酸化蛋白质组学 | MaxQuant搜索引擎 | -- | v.1.5.3.30 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基种类、血清浓度、培养条件（温度、O2、CO2）；MDA-MB-231, MCF7, A549, CAL51, HN6使用DMEM+7% FBS，HT1080使用RPMI 1640+7% FBS 阅读提示：Methods：Cell lines |
| 药物处理 | erastin浓度（如A549 4 μM, CAL51 20 μM等）、处理时间；PKC抑制剂Go6983和enzastaurin浓度；AAK1抑制剂SGC-AAK1-1浓度；Fer-1、DFO、NAC、Z-VAD-FMK、Nec浓度 阅读提示：Methods：Cell lines；Figure legends（图1、图3、图5） |
| 基因敲除 | sgRNA序列、载体、病毒包装系统、感染条件（polybrene浓度）、筛选浓度（puromycin） 阅读提示：Methods：Gene knockout by Crispr-cas9 system |
| 内吞检测 | TFR1抗体稀释比例、标记温度和时间、内吞时间（5或10分钟）、dynasore浓度 阅读提示：Methods：Endocytosis assays；Figure 1 legend |
| 铁水平检测 | 细胞接种密度、处理时间、试剂盒使用（总铁和亚铁） 阅读提示：Methods：Total and divalent iron assays |
| 细胞死亡和脂质过氧化检测 | 细胞接种密度、处理时间、染色浓度（PI 5 μg/ml，BODIPY 5 μM）、染色温度和时间、流式细胞仪设置 阅读提示：Methods：Cell death assays；Lipid peroxidation assays |
| 体外激酶实验 | 激酶和底物蛋白来源、ATP浓度、λ-磷酸酶处理、反应时间和温度 阅读提示：Methods：In vitro kinase assay |
| 免疫共沉淀 | 裂解缓冲液、抗体使用量、孵育时间和温度、beads使用量 阅读提示：Methods：Immunoblotting and immunoprecipitation |
| 异种移植模型 | 小鼠品系、周龄、性别；接种细胞数和部位；IKE、BSO、Lipro-1给药剂量、频率和途径；肿瘤测量公式 阅读提示：Methods：Xenograft tumor model；Figure 6 legend |