PS-NPs表征
验证PS-NPs的物理特性，为后续暴露实验提供材料依据。
通过SEM和TEM观察PS-NPs的形态和尺寸，测量其平均直径。
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聚苯乙烯纳米塑料诱导肺上皮细胞铁死亡通过YY1/FTL轴促进肺纤维化
Polystyrene nanoplastics-induced lung epithelial cells ferroptosis promotes pulmonary fibrosis via YY1/FTL axis.
实验完整度
高包含体外细胞模型、体内小鼠模型、转录组/蛋白质组学、组织病理学及分子机制验证等多层级实验。
主要模型
BEAS-2B人支气管上皮细胞 MRC-5人胚肺成纤维细胞 C57BL/6小鼠肺纤维化模型
重点核对
PS-NPs暴露浓度200 μg/mL，处理24小时 动物模型：C57BL/6小鼠经口咽吸入PS-NPs（25 μg/μL，每次50 μL，每周3次，共4周） YY1敲低：siRNA转染（体外）或SPC启动子驱动的shRNA腺病毒（体内） 铁死亡抑制剂Fer-1（10 μM）处理
摘要
纳米塑料（NPs）已成为普遍存在的环境污染物，聚苯乙烯纳米塑料（PS-NPs）越来越多地与肺毒性和纤维化相关。在此，我们通过重复口咽吸入PS-NPs建立了体外BEAS-2B支气管上皮损伤模型和体内小鼠模型。我们观察到显著的肺纤维化和肺泡II型细胞的铁死亡。整合的转录组和蛋白质组分析突出了铁死亡通路的富集，体外和体内实验证实PS-NPs抑制GPX4，同时诱导FTL，从而驱动脂质过氧化。机制上，YY1结合FTL启动子抑制其表达，而YY1敲低减轻铁死亡和纤维化。我们的研究结果确定YY1/FTL介导的铁死亡是PS-NPs诱导肺纤维化的关键机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PS-NPs诱导肺纤维化的分子机制是否涉及肺上皮细胞铁死亡以及YY1/FTL轴的调控作用。
- 核心机制
- PS-NPs暴露上调YY1，YY1直接结合FTL启动子抑制其转录，导致GPX4抑制和脂质过氧化，从而诱导肺上皮细胞铁死亡，进而通过旁分泌作用激活成纤维细胞，促进肺纤维化。
- 主要证据
- 体内外实验证实PS-NPs暴露后GPX4下调、FTL上调、铁过载和脂质过氧化；ChIP和分子对接验证YY1与FTL启动子结合；YY1敲低恢复GPX4、增强FTL表达、减轻铁死亡和纤维化。
- 研究意义
- 该研究为纳米塑料相关肺纤维化的治疗提供了潜在靶点，即上皮YY1和铁死亡。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞模型建立
研究PS-NPs对支气管上皮细胞（BEAS-2B）的毒性作用和机制。
BEAS-2B细胞暴露于不同浓度的PS-NPs（0-200 μg/mL）或一定时间（0-24小时），检测细胞活力、蛋白表达和铁死亡标志物。
体内小鼠模型建立
评估PS-NPs暴露对小鼠肺部的毒性作用，验证体外观察到的纤维化和铁死亡现象。
C57BL/6小鼠通过口咽吸入PS-NPs（25 μg/μL，每次50 μL）每周3次，连续4周，然后进行组织学、生化及蛋白检测。
转录组和蛋白质组分析
探索PS-NPs处理后差异表达的基因和蛋白，以确定关键通路和调控分子。
对PS-NPs处理的BEAS-2B细胞进行RNA-seq和蛋白质组学分析，鉴定差异表达基因和蛋白，并进行KEGG和PPI分析。
铁死亡验证
验证PS-NPs是否诱导铁死亡，并确定其作用特征。
检测铁死亡相关指标，如GPX4、FTL、ACSL4表达，GSH、SOD、MDA水平，铁含量，脂质过氧化和线粒体形态。
机制研究
阐明PS-NPs诱导FTL上调的分子机制，特别是YY1的调控作用。
结合生信预测、分子对接、ChIP实验和siRNA敲低等手段，验证YY1与FTL启动子结合及对FTL的转录抑制。
功能验证
验证YY1在PS-NPs诱导的铁死亡和纤维化中的作用。
在BEAS-2B细胞中敲低YY1，检测铁死亡标志物和成纤维细胞激活情况；在体内使用SPC启动子驱动的shYY1腺病毒特异性敲低AT2细胞中的YY1，评估对肺纤维化的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Life Technologies/Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | 1027-106 | |
| 青霉素和链霉素 | Life Technologies/Gibco | -- | |
| 药物处理 | Ferrostatin-1 | -- | SML0583 |
| Necrostatin-1 | -- | -- | |
| Z-VAD-FMK | -- | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P1046 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0009 | |
| PVDF膜 | Millipore Corporation | -- | |
| GPX4抗体 | Abways | CY6959 | |
| FTH1抗体 | Abways | CY5648 | |
| FTL抗体 | Proteintech | 10727-1-AP | |
| α-SMA抗体 | Abways | CY5295 | |
| COL1抗体 | Proteintech | 14695-1-AP | |
| YY1抗体 | Cell Signaling | 46395 | |
| β-actin抗体 | Sigma | sc-69879 | |
| 山羊抗兔IgG | Sigma | A0545 | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Takara | -- |
| NanoDrop 8000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Omniscript反转录试剂盒 | Takara | -- | |
| TB green | Takara | -- | |
| 罗氏LightCycler 480系统 | Roche | -- | |
| 转录组分析 | NEBNext® Ultra™ II | -- | -- |
| NovaSeq 6000测序平台 | -- | -- | |
| 蛋白质组分析 | Orbitrap Exploris 480质谱仪 | -- | -- |
| 生化检测 | 羟脯氨酸测定试剂盒 | Jiancheng Bioengineering Institute | A030-2-1 |
| SOD测定试剂盒 | Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering | A001-3 | |
| MDA测定试剂盒 | Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering | A003-2 | |
| GSH测定试剂盒 | Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering | A006-2 | |
| 脂质过氧化检测 | C11-BODIPY581/591荧光探针 | ABclonal | RM02821 |
| 铁检测 | 铁比色测定试剂盒 | Elabscience | E-BC-K139-M |
| FerroOrange荧光探针 | Serve Life Science | MX4559-48UG | |
| ChIP | Smart-ChIP染色质免疫沉淀试剂盒 | Engibody | ChIP-1001 |
| 免疫荧光 | 双标记TSA试剂盒 | Aifang Bio | AFIHC023 |
| SP-C抗体 | Affinity | DF6647 | |
| 成像 | 共聚焦显微镜 | Nikon | -- |
| Tanon-5200成像系统 | Tanon Company | -- | |
| PS-NPs表征 | 扫描电子显微镜 | ZEISS | GeminiSEM |
| 透射电子显微镜 | FEI | Talos |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞实验 | BEAS-2B细胞培养条件（DMEM含10% FBS和抗生素），PS-NPs暴露浓度（200 μg/mL）和时间（24小时） 阅读提示：见Materials and methods的Cell culture and treatment部分 |
| 动物实验 | C57BL/6小鼠周龄（6-8周）、性别（雄性）、PS-NPs剂量（25 μg/μL，每次50 μL）和给药频率（每周3次，共4周） 阅读提示：见Materials and methods的Animal study design部分 |
| 铁死亡检测 | GPX4、FTL、ACSL4蛋白表达，GSH、SOD、MDA水平，铁含量，脂质过氧化（C11-BODIPY）检测条件 阅读提示：见Results的PS-NPs trigger ferroptosis部分及相应图注 |
| 机制研究 | YY1敲低方式（siRNA序列、浓度），ChIP实验条件（抗体、引物、富集计算） 阅读提示：见Materials and methods的Chromatin immunoprecipitation (ChIP)部分 |
| 体内干预 | AAV-shYY1递送剂量（约6.28×10^10 vg/小鼠），给药途径（气管内）及PS-NPs暴露时序 阅读提示：见Results的AAV-YY1 alleviates部分及图7A示意 |