筛选m6A修饰的铁死亡相关lncRNA
利用MeRIP-seq和RNA-seq数据集成分析，鉴定LUAD中异常表达的m6A修饰lncRNA，并筛选与铁死亡相关的候选lncRNA。
对8对LUAD组织进行MeRIP-seq和RNA-seq，结合TCGA、GEO等公共数据库进行差异表达分析和Pearson相关性分析，筛选出RBMS3-AS3。
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M6A-ALKBH5依赖的RBMS3-AS3下调通过HNRNPDL/ZEB1/GPX4轴抑制铁死亡以促进肺腺癌进展
M6A-ALKBH5-dependent RBMS3-AS3 down-regulation suppresses ferroptosis to promote lung adenocarcinoma progression through HNRNPDL/ZEB1/GPX4 axis.
实验完整度
高包含MeRIP-seq/RNA-seq筛选、体外细胞功能与铁死亡检测、体内异种移植瘤模型、机制验证（RIP、ChIP、双荧光素酶等）等至少两个独立证据层级。
主要模型
A549细胞 PC9细胞 16HBE细胞 BALB/c裸鼠异种移植瘤模型
重点核对
LUAD细胞系A549和PC9中RBMS3-AS3的敲低和过表达效率 RSL3和Fer-1的浓度及处理时间（1.0 μM，24小时） ALKBH5调控RBMS3-AS3的m6A修饰水平 ZEB1与GPX4启动子E-box的结合位点 HNRNPDL与RBMS3-AS3及ZEB1 mRNA的结合区域
摘要
N6-甲基腺苷（m6A）甲基化修饰可通过调控基因表达影响肺腺癌（LUAD）的进展。铁死亡是一种新型的调控性细胞死亡，参与多种恶性肿瘤的进展。本研究旨在阐明m6A修饰的铁死亡相关长链非编码RNA（lncRNA）在LUAD中的作用。通过整合本队列样本和公共数据库的MeRIP-seq和RNA-seq数据，我们鉴定出lncRNA RBMS3-AS3在LUAD中异常下调。RBMS3-AS3的低表达预示LUAD患者预后不良。RBMS3-AS3被m6A“橡皮擦”ALKBH5以m6A依赖方式下调。RBMS3-AS3表达的降低通过抑制铁死亡在体外和体内促进LUAD进展。机制上，RBMS3-AS3直接结合HNRNPDL，将其从细胞核招募到细胞质中以稳定ZEB1 mRNA。ZEB1与GPX4启动子中的E-box基序相互作用，抑制GPX4转录，从而促进铁死亡。总之，被ALKBH5表观遗传下调的RBMS3-AS3通过HNRNPDL/ZEB1/GPX4轴抑制铁死亡，从而促进LUAD进展，并可能成为LUAD的新型治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- m6A修饰的铁死亡相关lncRNA在肺腺癌进展中的作用及分子机制是什么？
- 核心机制
- ALKBH5以m6A依赖方式下调RBMS3-AS3，减少RBMS3-AS3与HNRNPDL的结合，导致HNRNPDL核转位减少，进而降低ZEB1 mRNA稳定性，ZEB1表达下调，解除对GPX4转录的抑制，GPX4表达升高，从而抑制铁死亡并促进LUAD进展。
- 主要证据
- 通过MeRIP-seq和RNA-seq筛选，RT-qPCR和WB验证表达；体外功能实验（CCK-8、EdU、集落形成、transwell）和体内异种移植瘤实验显示RBMS3-AS3下调促进肿瘤生长并抑制铁死亡；RIP、RNA pull-down、ChIP、双荧光素酶报告基因等实验验证了RBMS3-AS3与HNRNPDL、HNRNPDL与ZEB1 mRNA、ZEB1与GPX4启动子的相互作用。
- 研究意义
- RBMS3-AS3可能作为LUAD的新型治疗靶点，本研究为靶向铁死亡通路的治疗策略提供了理论依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证RBMS3-AS3表达及预后关联
验证RBMS3-AS3在LUAD中的表达水平及其与患者预后的关系。
通过RT-qPCR检测32对LUAD临床样本中RBMS3-AS3的表达，并利用Kaplan-Meier分析评估其与总生存期的关系。
研究m6A修饰对RBMS3-AS3的调控
探讨ALKBH5是否通过m6A修饰调控RBMS3-AS3的表达。
通过RIP、MeRIP-qPCR、放线菌素D处理等实验，检测ALKBH5与RBMS3-AS3的相互作用及m6A水平变化。
评估RBMS3-AS3对细胞增殖、迁移和铁死亡的影响
检测RBMS3-AS3对LUAD细胞增殖、迁移及铁死亡相关指标的影响。
使用CCK-8、EdU、集落形成、transwell实验评估细胞功能，并用RSL3或Fer-1处理检测铁死亡指标。
验证体内RBMS3-AS3对肿瘤生长和铁死亡的影响
通过异种移植瘤模型验证RBMS3-AS3在体内对肿瘤生长和铁死亡的作用。
将敲低或过表达RBMS3-AS3的A549细胞皮下接种裸鼠，测量肿瘤体积和重量，并通过免疫组化检测Ki67和GPX4表达。
研究ZEB1在RBMS3-AS3调控肿瘤进展和铁死亡中的作用
探究ZEB1是否是RBMS3-AS3调控肿瘤进展和铁死亡的关键下游分子。
通过敲低或过表达ZEB1，观察对细胞功能、铁死亡指标及异种移植瘤生长的影响，并在RBMS3-AS3敲低细胞中回补ZEB1。
验证ZEB1对GPX4转录的调控
验证ZEB1是否通过结合GPX4启动子抑制其转录。
通过ChIP、RT-qPCR、WB和双荧光素酶报告基因实验检测ZEB1与GPX4启动子的结合及对GPX4表达的影响。
鉴定RBMS3-AS3相互作用蛋白
寻找介导RBMS3-AS3调控ZEB1 mRNA稳定性的RNA结合蛋白。
通过RNA pull-down、质谱分析、RIP、FISH等实验鉴定HNRNPDL为RBMS3-AS3的结合蛋白，并验证其相互作用。
研究HNRNPDL对ZEB1 mRNA稳定性的影响
验证HNRNPDL是否通过结合ZEB1 mRNA 3'-UTR调控其稳定性。
通过mRNA稳定性实验、双荧光素酶报告基因实验和功能回补实验，验证HNRNPDL对ZEB1 mRNA的稳定化作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA测序文库构建 | Epicentre Ribo-Zero Gold试剂盒 | Illumina | -- |
| RNA片段化 | 镁离子RNA片段化模块 | NEB | e6150 |
| MeRIP | m6A特异性抗体 | Synaptic Systems | 202003 |
| 逆转录 | SuperScript™ II逆转录酶 | Invitrogen | 1896649 |
| 双链DNA合成 | 大肠杆菌DNA聚合酶I | NEB | m0209 |
| 核糖核酸酶H | NEB | m0297 | |
| dUTP溶液 | Thermo Fisher | R0133 | |
| 文库构建 | AMPureXP磁珠 | -- | -- |
| UDG酶 | NEB | m0280 | |
| 测序 | Illumina NovaSeq™ 6000测序仪 | Illumina | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素和链霉素 | Beyotime | -- | |
| 支原体检测 | N-GRADE支原体PCR试剂盒 | Euroclone S.p.A. | -- |
| 细胞鉴定 | STR分型 | Eurofins | -- |
| MeRIP | Magna MeRIP m6A试剂盒 | Millipore | -- |
| 抗m6A抗体 | Abcam | ab284130 | |
| 正常兔IgG | Proteintech | 30000-0-AP | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 慢病毒感染 | HiTransG A感染增强液 | GeneChem | -- |
| HiTransG P感染增强液 | GeneChem | -- | |
| RT-qPCR | SYBR Green Mix | Vazyme | -- |
| 细胞活力检测 | CCK-8细胞计数试剂盒 | Vazyme | A311-01 |
| 集落形成 | 结晶紫溶液 | Beyotime | -- |
| EdU实验 | YF®555 Click-iT EdU成像试剂盒 | Proteinbio | PC5516 |
| Transwell实验 | Transwell上室 | Corning | -- |
| 铁死亡诱导 | RSL3 | MedChemExpress | HY-100218A |
| 铁死亡抑制 | Ferrostatin-1 | MedChemExpress | HY-100579 |
| MDA检测 | MDA检测试剂盒 | DOJINDO | M496 |
| Fe2+检测 | FerroOrange探针 | DOJINDO | F374 |
| 亚铁离子比色检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K773-M | |
| 脂质ROS检测 | C11-BODIPY581/591探针 | Thermo Scientific | D3861 |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | Gempharmatech | -- |
| 免疫组化 | ZEB1抗体 | Proteintech | 21544-1-AP |
| Ki67抗体 | CST | 12202S | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | MCE | -- | |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | -- |
| ECL底物 | ABclonal | RM00021 | |
| 双荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Vazyme | -- |
| 核质分离 | PARIS™试剂盒 | Thermo Scientific | AM1921 |
| RNA pull-down | RNA-蛋白pull-down试剂盒 | Geneseed | P0202 |
| 银染 | 快速银染试剂盒 | Beyotime | P0017S |
| RIP | Magna RIP RBP免疫沉淀试剂盒 | Millipore | -- |
| ChIP | 酶法ChIP检测试剂盒 | Beyotime | P2083S |
| FISH | Ribo荧光原位杂交试剂盒 | RiboBio | C10910 |
| 荧光成像 | Stellaris STED激光扫描共聚焦显微镜 | Leica | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | LUAD细胞系和16HBE的培养条件（培养基、血清浓度、抗生素） 阅读提示：Methods: Cell lines and reagents |
| 药物处理 | RSL3和Fer-1的浓度（1.0 μM）和处理时间（24小时） 阅读提示：Methods: Assessment of ferroptosis |
| 基因操作 | siRNA和过表达质粒的序列及转染效率 阅读提示：Methods: Plasmids and siRNAs transfection; Table S11 |
| 体内实验 | 小鼠品系、周龄、性别、细胞接种量、肿瘤测量时间 阅读提示：Methods: Xenograft mouse models |
| 机制验证 | RBMS3-AS3的片段（113-339 nt）、HNRNPDL的RRM1和RRM2结构域、ZEB1结合GPX4启动子E-box基序 阅读提示：Methods: RNA pull-down assay, ChIP assay; Results sections |