VB2代谢活性评估
评估HCC肿瘤中VB2代谢活性。
基于VB2代谢基因签名计算VB2代谢评分，比较肿瘤与非肿瘤组织。
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FAD合酶赋予肝细胞癌铁死亡抗性并抑制CD8+ T细胞募集
FAD synthase confers ferroptosis resistance and restrains CD8+ T cell recruitment in hepatocellular carcinoma.
实验完整度
高包含多层级证据：临床样本分析、细胞功能实验、动物模型、单细胞转录组、代谢组学及机制验证（如Co-IP、泛素化）。
主要模型
Hep3B细胞 HCCLM3细胞 Hepa1-6小鼠肝癌细胞 C57BL/6和Rag1-/-小鼠异种移植模型
重点核对
FADS敲低方式：shRNA序列（shFLAD1） 细胞系：Hep3B、HCCLM3、Hepa1-6 给药剂量：VB2、FMN、FAD 50 mg/kg（瘤内），橙皮苷100 mg/kg（腹腔注射） 处理浓度：VB2、FMN、FAD 10 µM（体外），橙皮苷100 µM 小鼠模型：C57BL/6和Rag1-/-，皮下及原位
摘要
维生素B2（VB2）代谢调控多种细胞过程，但其在肝细胞癌（HCC）进展中的作用仍不清楚。在此，我们表明HCC肿瘤以VB2代谢特征的上调为特征，且VB2代谢促进HCC进展。在VB2代谢酶中，黄素腺嘌呤二核苷酸合酶（FADS）是唯一在人HCC中广泛过表达的酶。FADS表达升高与抗PD-1治疗耐药和不良预后相关。在体内，FADS促进HCC细胞生长并抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫。单细胞转录组分析揭示FADS诱导的变化发生在肿瘤细胞和瘤内CD8+ T细胞中。敲低FADS诱导HCC细胞死亡并增加CD8+ T细胞浸润。机制上，FADS通过其酶功能产生FAD和非酶功能稳定PCBP2，赋予HCC细胞铁死亡抗性。此外，FADS通过破坏cGAS-STING通路损害CD8+ T细胞募集。橙皮苷，一种临床批准的FADS抑制剂，在小鼠模型中显示出抗肿瘤功效。因此，我们的研究强调了VB2代谢在HCC中的重要性，并为靶向FADS作为HCC的治疗策略提供了原理证明。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- VB2代谢在肝细胞癌进展中的作用及其机制。
- 核心机制
- FADS通过酶活性产生FAD维持GR活性及GSH水平，并通过非酶功能招募USP10去泛素化稳定PCBP2，从而抵抗铁死亡；同时通过抑制cGAS-STING通路减少CD8+ T细胞募集。
- 主要证据
- 多种HCC细胞系和动物模型实验表明FADS敲低抑制肿瘤生长并诱导铁死亡，CD8+ T细胞浸润增加；IP-MS、Co-IP、泛素化实验和代谢物检测支持机制。
- 研究意义
- FADS是HCC的潜在治疗靶点，橙皮苷作为FADS抑制剂具有治疗前景。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
FADS表达分析
明确FADS在HCC中的表达模式。
分析18个HCC数据集及临床样本中FLAD1表达。
细胞功能实验
验证FADS对HCC细胞恶性行为的影响。
敲低或过表达FADS，检测增殖、迁移、侵袭。
体内肿瘤模型
评估FADS在体内对肿瘤生长和免疫的影响。
在免疫缺陷和免疫健全小鼠中建立皮下和原位肿瘤模型。
单细胞转录组分析
解析FADS对肿瘤微环境的影响。
对小鼠肿瘤进行scRNA-seq，分析细胞类型和基因表达变化。
机制研究
阐明FADS调控铁死亡和CD8+ T细胞募集的分子机制。
检测ROS、脂质过氧化、DNA损伤、cGAS-STING通路、PCBP2相互作用及泛素化。
药物筛选与验证
筛选并验证FADS抑制剂。
基于结构的虚拟筛选，并用橙皮苷进行体外和体内验证。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 人表皮生长因子 | -- | -- | |
| Ham's F-12培养基 | -- | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 细胞处理 | 维生素B2 | MCE | HY-B0456 |
| 黄素单核苷酸 | MCE | HY-B0964 | |
| 黄素腺嘌呤二核苷酸 | MCE | HY-B1654 | |
| 光黄素 | MCE | HY-121608 | |
| H-151 | MCE | HY-112693 | |
| 刺槐苷 | TargetMol | T2S0265 | |
| 芦丁水合物 | TargetMol | T22417 | |
| 甜菊双糖苷 | TargetMol | T4964 | |
| 蒙花苷 | TargetMol | T6S0653 | |
| 橙皮苷 | TargetMol | T1035 | |
| RT-qPCR | 总RNA提取试剂盒 | Vazyme | -- |
| HiScript逆转录预混液 | Vazyme | -- | |
| SYBR Green PCR预混液 | Vazyme | -- | |
| QuantStudio 3实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| β-actin抗体 | CST | 4970 | |
| RFK抗体 | Santa Cruz | sc-398830 | |
| FADS抗体 | Proteintech | 68491-1-Ig | |
| PCBP2抗体 | ABclonal | A23987 | |
| FLAG标签抗体 | ABclonal | AE005 | |
| His标签抗体 | ABclonal | AE003 | |
| HA标签抗体 | ABclonal | AE008 | |
| USP10抗体 | Proteintech | 19374-1-AP | |
| cGAS抗体 | Proteintech | 26416-1-AP | |
| STING抗体 | Proteintech | 80365-RR | |
| TBK1抗体 | CST | 3504 | |
| 磷酸化TBK1抗体 | CST | 5483 | |
| IRF3抗体 | Proteintech | 11312-1 | |
| 磷酸化IRF3抗体 | CST | 29047 | |
| HRP标记二抗 | -- | -- | |
| ECL化学发光试剂 | -- | -- | |
| IHC | RFK抗体 | Atlas | HPA057163 |
| FADS抗体 | Affinity | DF14820 | |
| PCBP2抗体 | Abcam | ab184962 | |
| CD8α抗体 | Abcam | ab245118 | |
| EDTA缓冲液 | -- | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| Thunder成像系统 | Leica | -- | |
| SlideViewer软件 | 3DHISTECH | -- | |
| 免疫沉淀 | Protein A/G磁珠 | Selleck | -- |
| FADS抗体 | Santa Cruz | sc-376819 | |
| PCBP2抗体 | ABclonal | A23987 | |
| FLAG标签抗体 | ABclonal | AE005 | |
| His标签抗体 | ABclonal | AE003 | |
| 质谱 | Easy-nLC 1000-Q Exactive液相色谱质谱联用仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 免疫荧光 | γ-H2AX抗体 | ABclonal | AP0687 |
| Alexa Fluor 488荧光二抗 | -- | -- | |
| Alexa Fluor 594荧光二抗 | -- | -- | |
| Quant-iT PicoGreen双链DNA试剂 | Invitrogen | P7581 | |
| 共聚焦显微镜 | Olympus | -- | |
| 代谢组学 | Vanquish超高效液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Orbitrap Q Exactive™ HF质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Compound Discoverer 3.3软件 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| FAD测量 | FAD检测试剂盒 | Abcam | ab204710 |
| 去蛋白样品制备试剂盒 | AAT Bioquest | 19501 | |
| CCK-8 | CCK-8溶液 | Beyotime | -- |
| 克隆形成 | 结晶紫 | Beyotime | -- |
| 迁移和侵袭 | Transwell小室 | Corning | -- |
| Matrigel基质胶 | Corning | -- | |
| ROS | 二氢乙锭 | MCE | HY-D0079 |
| 活性铁 | FerroOrange探针 | Dojindo | F374 |
| 流式 | 流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| ROS | SpectraMax iD3酶标仪 | Molecular Devices | -- |
| 脂质过氧化 | BODIPY 581/591 C11探针 | Invitrogen | D3861 |
| 丙二醛比色分析试剂盒 | Elabscience | E-BC-K028 | |
| GSH检测 | GSH比色分析试剂盒 | Elabscience | E-BC-K097 |
| GR活性 | 谷胱甘肽还原酶比色分析试剂盒 | Elabscience | E-BC-K099 |
| 细胞死亡 | 7-AAD染色液 | -- | -- |
| 流式 | 胶原酶 | Sigma-Aldrich | -- |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma-Aldrich | -- | |
| LIVE/DEAD可固定活力染料 | eBioscience | -- | |
| Brilliant Violet 650标记抗小鼠CD8α抗体 | BioLegend | 100741 | |
| PE标记抗小鼠CD279（PD-1）抗体 | BioLegend | 114117 | |
| 细胞活化混合物 | BioLegend | 423303 | |
| 固定/破膜溶液 | BD Biosciences | -- | |
| 破膜/洗涤溶液 | BD Biosciences | -- | |
| PE/Cy7标记抗小鼠IFNγ抗体 | BioLegend | 505826 | |
| FACSCelesta流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 测序 | U-mRNAseq文库制备试剂盒 | KAITAI-BIO | AT4221 |
| Ribo-off rRNA去除试剂盒 | Vazyme | N407 | |
| Illumina NovaSeq X Plus PE150测序平台 | Illumina | -- | |
| 单细胞测序 | 多组织解离试剂盒 | -- | -- |
| SeekOne MM单细胞3'文库制备试剂盒 | -- | -- | |
| Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| DNBelab C-TaiM4系统 | MGI | -- | |
| DNBSEQ-T7RS测序平台 | MGI | -- | |
| 小鼠模型 | Matrigel基质胶 | Corning | -- |
| IVIS 100活体成像系统 | Xenogen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | 细胞系来源与培养条件：Hep3B、HCCLM3、Hepa1-6、293T、THLE-2的培养基和添加物；VB2、FMN、FAD、lumiflavin、橙皮苷的浓度和处理时间。 阅读提示：Methods: Cell culture和Chemicals |
| 基因敲低与过表达 | shRNA序列（shRFK、shFLAD1、shFlad1）及转染方法；过表达构建和筛选方法。 阅读提示：Methods: Cell transfection |
| 体内肿瘤模型 | 小鼠品系（C57BL/6和Rag1-/-）来源和年龄；细胞接种数量、注射体积和基质胶比例；VB2/FMN/FAD给药剂量（50 mg/kg）和途径；橙皮苷剂量（100 mg/kg）和途径。 阅读提示：Methods: Mice |
| 流式分析 | 抗体克隆号、荧光标记和稀释比例；CD8+ T细胞刺激条件（Cell Activation Cocktail浓度和时间）。 阅读提示：Methods: Flow cytometry for intratumoral CD8+ T cells |
| 铁死亡检测 | ROS、脂质过氧化、活性铁检测探针浓度和孵育时间；GSH/GSSG和GR活性检测试剂盒。 阅读提示：Methods: ROS, lipid peroxidation and labile iron pool, GSH, GSH/GSSG ratio, and glutathione reductase (GR) activity |