circRNA载体构建与circILNb工程化
构建无疤circRNA载体circCV-B3，并工程化共编码IL-15和抗PD-L1纳米抗体的circILNb。
基于PIE系统设计circCV-B3载体，通过突变CVB3 IRES隐藏剪接位点，实现无缝环化；将IL-15和Nb编码序列克隆入载体，体外转录合成circRNA。
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通过体外转录的circILNb局部递送IL-15和抗PD-L1纳米抗体在冷肿瘤中引发优越的抗肿瘤免疫
Local delivery of IL-15 and anti-PD-L1 nanobody by in vitro-transcribed circILNb elicits superior antitumor immunity in cold tumors.
实验完整度
高包含体外细胞实验、多种小鼠肿瘤模型、患者样本（未提及）、流式细胞术、RNA-seq等多层级功能与机制验证。
主要模型
B16F10黑色素瘤小鼠模型 RM-1前列腺癌小鼠模型 4T1乳腺癌小鼠模型 CT26结直肠癌小鼠模型
重点核对
circRNA的环化效率（circCV-B3为90%，circRNA-PIE为70%） circRNA纯化方法（BAPS vs RNase R+HPLC） 瘤内注射剂量（0.5 mg/kg） 肿瘤模型类型（B16F10, RM-1, 4T1, CT26） 免疫细胞耗竭实验（CD8+ T, NK, CD4+）
摘要
Niu等人构建了circCV-B3载体，以实现无疤环状RNA（circRNA）工程。利用circCV-B3载体，他们工程化了circILNb，用于共同编码IL-15和抗PD-L1纳米抗体。此外，他们证明了circILNb对局部和远端肿瘤的有效抑制。作者还证明了circILNb与基于蛋白质的疗法相比具有优越的抗肿瘤功效。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何利用circRNA技术实现IL-15和抗PD-L1纳米抗体的局部递送，以克服冷肿瘤免疫治疗的局限性？
- 核心机制
- circILNb通过编码IL-15和抗PD-L1纳米抗体，在肿瘤内原位表达，激活预先存在的CD8+ T细胞和NK细胞，并通过树突状细胞迁移至肿瘤引流淋巴结，启动系统性抗肿瘤免疫。
- 主要证据
- 在四种冷肿瘤模型（B16F10, RM-1, 4T1, CT26）中，circILNb显著抑制肿瘤生长并延长生存期；流式细胞术显示CD8+ T和NK细胞扩增和活化；RNA-seq和RT-qPCR证实T细胞活化相关基因上调。
- 研究意义
- circILNb代表了一种基于非蛋白的肿瘤免疫治疗策略，为circRNA工程和联合免疫治疗提供了新方法。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
circILNb的体外表达验证
验证circILNb在细胞中正确表达IL-15和Nb蛋白。
转染HEK293T细胞后，通过Western blot检测上清中IL-15和Nb表达。
circILNb的体内分布与表达
评估circILNb经瘤内注射后在肿瘤内的原位表达和分布。
B16F10荷瘤小鼠瘤内注射circILNb，通过免疫荧光和流式细胞术检测Nb在肿瘤组织中的表达和细胞定位。
circILNb的体内抗肿瘤疗效评估
评估circILNb对多种冷肿瘤模型的肿瘤生长抑制和生存期延长效果。
在B16F10、RM-1、4T1和CT26肿瘤模型中，瘤内注射circILNb，监测肿瘤生长和生存期。
免疫细胞分析
分析circILNb对肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的扩增和活化作用。
流式细胞术分析肿瘤组织中CD8+ T细胞、NK细胞、Treg等免疫细胞的比例和功能标志物表达。
转录组分析
揭示circILNb对TILs转录组的影响。
对circILNb或对照处理的B16F10-OVA肿瘤中的TILs进行RNA-seq分析，并验证关键基因表达。
远隔效应评估
评估瘤内注射circILNb能否抑制未治疗的对侧肿瘤和肺转移灶。
双侧肿瘤模型：右侧肿瘤注射circILNb，观察左侧肿瘤生长；肺转移模型：静脉注射B16F10细胞，观察肺转移灶数量。
与蛋白疗法的比较
比较circILNb与临床蛋白疗法（N-803+αPD-L1和N-809）的抗肿瘤效果和安全性。
在相同肿瘤模型中，分别给予circILNb、N-803+αPD-L1、N-809，比较肿瘤生长、生存期和体重变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| circRNA合成 | T7高产RNA转录试剂盒 | New England Biolabs | E2050S |
| circRNA纯化 | RNase R | Novoprotein | GMP-E224-U025 |
| 高效液相色谱 | Waters | -- | |
| LNP制备 | SM-102 | AVT | O02010 |
| 二硬脂酰磷脂酰胆碱 | AVT | S01005 | |
| 胆固醇 | AVT | O01001 | |
| DMG-PEG2000 | AVT | O02005 | |
| 细胞培养 | 青霉素-链霉素溶液 | BioChannel Biological Technology | BC-CE-007 |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Beyotime | C0037 |
| 流式细胞术 | Zombie Aqua固定活力试剂盒 | BioLegend | 423102 |
| 免疫细胞分离 | 小鼠CD8+ T细胞分离试剂盒 | UElandy | M7402 |
| EasySort小鼠NK细胞分离试剂盒 | Elabscience | MIM005N | |
| 细胞因子检测 | IL-15 ELISA试剂盒 | Wuhan Fine Biotech | EM1156 |
| 蛋白表达检测 | 抗HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 |
| 抗小鼠PD-L1抗体 | Proteintech | 17952-1-AP | |
| 抗IL-15抗体 | Invitrogen | PA5-34511 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| circRNA合成与纯化 | circRNA环化效率（90%）、纯化方法（BAPS vs RNase R+HPLC）、T7转录条件 阅读提示：STAR Methods, circRNA synthesis; circRNA purification |
| LNP封装 | 脂质摩尔比（SM-102:DSPC:胆固醇:DMG-PEG2000 = 50:10:38.5:1.5）、微流控流速（12 mL/min）、封装效率（>98%） 阅读提示：STAR Methods, Lipid nanoparticle encapsulation and characterization |
| 动物模型 | 品系（C57BL/6J, BALB/c）、性别（雌性）、年龄（6-8周）、肿瘤细胞系（B16F10, RM-1, 4T1, CT26）、接种方式（皮下、原位）、接种数量 阅读提示：STAR Methods, Experimental model and study participant details; Tumor inoculation |
| 给药方案 | circRNA剂量（0.5 mg/kg）、注射途径（瘤内）、注射频率（每5天）、对照组（circLuc） 阅读提示：STAR Methods, In vivo drug administration |
| 免疫细胞分析 | 组织消化条件（1 mg/mL胶原酶I、0.5 mg/mL DNase I、50分钟）、流式抗体、破膜固定试剂盒 阅读提示：STAR Methods, Cell preparation and flow cytometry analysis |