circPSD3表达及特征鉴定
验证circPSD3在甲状腺癌中高表达及其环状RNA特性。
通过RNA测序筛选、qPCR验证、RNase R处理、Sanger测序、FISH等检测circPSD3表达和定位。
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CircPSD3通过调控SUCLG2维持TCA循环和线粒体功能促进甲状腺癌进展
CircPSD3 aggravates tumor progression by maintaining TCA cycle and mitochondrial function via regulating SUCLG2 in thyroid carcinoma.
实验完整度
高包含体外（细胞增殖、凋亡、代谢检测）及体内（异种移植瘤）功能验证，并通过蛋白质组学、代谢组学及分子机制（RNA pull-down、RIP、双荧光素酶）验证机制（circPSD3/miR-338-5p/SUCLG2轴）。
主要模型
甲状腺癌细胞系TPC-1和8305C BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型 甲状腺癌临床组织样本
重点核对
circPSD3在甲状腺癌组织及细胞系中的表达水平（RNA-seq、qPCR验证） shRNA敲低circPSD3的效率及对细胞增殖（CCK-8、EdU）和凋亡（流式）的影响 circPSD3对SUCLG2蛋白表达及TCA循环代谢物（α-KG、琥珀酸）的影响 miR-338-5p抑制剂或SUCLG2过表达对表型的恢复作用 动物实验中肿瘤体积、重量及Ki67表达
摘要
近年来，甲状腺癌（TC）的发病率迅速上升。我们的研究聚焦于环状RNA对甲状腺癌代谢的调控作用，旨在为TC的进展机制提供新的见解，并为其提供潜在的治疗靶点。在本研究中，我们通过RNA测序鉴定了circPSD3在TC组织中的高表达。乳头状甲状腺癌组织队列证实circPSD3表达水平与较大的肿瘤大小呈正相关。circPSD3在体外和体内均促进TC细胞增殖并减少凋亡。蛋白质组学和代谢组学提示circPSD3可能在调控三羧酸（TCA）循环中发挥关键作用。具体而言，circPSD3作为miR-338-5p的海绵上调SUCLG2（一种TCA循环酶），加速α-酮戊二酸（α-KG）向琥珀酸的转化。敲低circPSD3会破坏TCA循环并损害线粒体功能，导致膜电位和有氧呼吸速率降低。线粒体功能的降低导致增殖抑制和线粒体介导的凋亡的启动。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- circPSD3在甲状腺癌中的表达及其对肿瘤进展和代谢的调控机制是什么？
- 核心机制
- circPSD3作为miR-338-5p的海绵，上调SUCLG2，加速α-KG向琥珀酸转化，维持TCA循环和线粒体功能，从而促进增殖并抑制凋亡。
- 主要证据
- 体内外功能实验显示circPSD3敲低抑制增殖并诱导凋亡；蛋白质组学、代谢组学及OCR、MMP检测显示TCA循环受损；RNA pull-down和双荧光素酶验证了circPSD3与miR-338-5p的直接结合。
- 研究意义
- 揭示circPSD3-miR-338-5p-SUCLG2轴在甲状腺癌中的调控作用，提示circPSD3可作为潜在的甲状腺癌治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内外功能实验
评估circPSD3对细胞增殖、凋亡及肿瘤生长的影响。
使用shRNA敲低circPSD3，检测细胞活力（CCK-8）、增殖（EdU）、凋亡（流式），并建立皮下移植瘤模型观察肿瘤生长。
代谢组学和蛋白质组学分析
探究circPSD3敲低后蛋白表达和代谢物的变化，明确其调控的代谢通路。
对敲低circPSD3的细胞进行蛋白质谱和代谢物LC-MS检测，并进行KEGG通路富集分析。
线粒体功能检测
验证circPSD3敲低对线粒体功能的影响。
检测OCR（Seahorse）、MMP（JC-1）、NAD+/NADH比值及Caspase-3活性。
代谢物回补实验
验证TCA循环中间产物（α-KG和琥珀酸）能否恢复circPSD3敲低导致的表型。
在敲低circPSD3的细胞培养基中添加α-KG和琥珀酸，检测MMP、凋亡、增殖及OCR。
分子机制验证
验证circPSD3作为miR-338-5p海绵调控SUCLG2。
RNA pull-down、RIP、双荧光素酶报告实验验证circPSD3与miR-338-5p结合，及miR-338-5p对SUCLG2的调控；通过过表达SUCLG2或抑制miR-338-5p进行功能回补实验。
体内机制验证
验证miR-338-5p抑制剂对circPSD3敲低引起的肿瘤生长抑制的回补作用。
在皮下移植瘤模型中，给予si-circPSD3和miR-338-5p抑制剂，观察肿瘤生长情况。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质印迹和RNA免疫沉淀 | SUCLG2抗体 | Proteintech | 14240-1-AP |
| OGDH抗体 | Proteintech | 15212-1-AP | |
| LaminB1抗体 | Abcam | ab16048 | |
| RNA免疫沉淀 | IgG抗体 | Abcam | ab6715 |
| HA抗体 | Abcam | ab9110 | |
| 细胞培养和慢病毒包装 | PEI转染试剂 | -- | -- |
| 细胞培养 | 聚凝胺 | -- | -- |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 核质RNA提取 | PARIS试剂盒 | Thermo Fisher | AM1921 |
| 细胞增殖检测 | Cell-Light EdU试剂盒 | RiboBio | C10310-1 |
| CCK-8试剂盒 | Ape×Bio | K1018 | |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒 | Elabscience | E-CK-A211 |
| 流式细胞术 | NovoCyte流式细胞仪 | Agilent Technologies | -- |
| 动物实验 | 基质胶 | Corning | 356234 |
| 代谢组学分析 | 1290 Infinity II液相色谱-质谱系统 | Agilent Technologies | -- |
| 氧耗率测量 | Seahorse XF96分析仪 | Agilent Technologies | -- |
| 寡霉素 | Agilent Technologies | -- | |
| FCCP | Agilent Technologies | -- | |
| 线粒体膜电位检测 | MitoProbe JC-1试剂盒 | Thermo Fisher | M34152 |
| NAD+/NADH检测 | NAD+/NADH比值检测试剂盒 | Beyotime | S0175 |
| 代谢物补充 | α-酮戊二酸 | Sigma | K1128 |
| 琥珀酸 | Sigma | PHR1418 | |
| 双荧光素酶报告实验 | 双荧光素酶报告系统 | Promega | E1910 |
| 免疫组化 | EDTA抗原修复液 | Solarbio | C1034 |
| DAB底物试剂盒 | Dako | K5007 | |
| RNA原位杂交 | 增强敏感原位杂交检测试剂盒 | BOSTER | MK1030 |
| Caspase-3活性检测 | Caspase-3活性检测试剂盒 | Beyotime | C1116 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源（TPC-1、8305C等）、培养条件（培养基类型、胎牛血清浓度、抗生素） 阅读提示：Methods - Cell lines and cell culture |
| circPSD3表达及特征鉴定 | RNA测序样本量（5对组织）、qPCR引物序列、RNase R处理条件（37℃, 20-30min） 阅读提示：Methods - Clinical samples, RNase R treatment, Results - Fig.1 |
| 细胞增殖和凋亡实验 | 细胞密度、处理时间（EdU 2h, 凋亡72h）、试剂盒型号 阅读提示：Methods - Cell proliferation assays, Cell apoptosis assays |
| 代谢组学和蛋白质组学 | 组学样本重复数（蛋白3个，代谢4个）、质谱分析平台 阅读提示：Methods - Proteomics, Metabolomics |
| 线粒体功能检测 | Seahorse细胞铺板密度（TPC-1 15000/孔, 8305C 20000/孔）、JC-1染色浓度和时间 阅读提示：Methods - Oxygen consumption rate measurement, Mitochondrial membrane potential detection |
| 分子机制验证 | shRNA和siRNA序列、miR-338-5p inhibitor序列、探针序列、RIP和pull-down实验条件 阅读提示：Methods - Antibodies and sequences, RNA immunoprecipitation, RNA pull-down |
| 动物实验 | 小鼠品系、周龄（BALB/c裸鼠，4周龄）、细胞注射数量（10^7）、siRNA和抑制剂剂量（2 nmol/只）、给药频率（每3天）、肿瘤体积测量公式 阅读提示：Methods - Animal experiments |
| 统计分析 | 独立重复次数（≥3）、正态性检验（Shapiro-Wilk）、统计检验方法选择 阅读提示：Methods - Statistical analysis |