生成K296E敲入小鼠
建立携带K296E突变的敲入小鼠模型以研究突变体在体内的致病机制。
使用CRISPR/Cas9基因编辑技术将K296E突变引入小鼠基因组，生成三个品系（K29-1、K29-4、K29-21），并通过测序确认突变。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
组成性活化的K296E视紫红质突变体的聚集促进视网膜变性
Aggregation of the Constitutively Active K296E Rhodopsin Mutant Contributes to Retinal Degeneration.
实验完整度
高包含CRISPR/Cas9敲入小鼠模型、体外FRET聚集检测、免疫组化、TUNEL凋亡检测等多层级证据，且进行了功能验证（ERG）和机制验证（聚集与细胞死亡关系）。
主要模型
K296E视紫红质敲入小鼠（RhoK296E/+和RhoK296E） HEK293T/17细胞 G90D视紫红质转基因小鼠（RhoTgG90D）
重点核对
小鼠品系：C57Bl/6J背景，RhoK296E敲入小鼠由CRISPR/Cas9生成，K29-1、K29-4、K29-21三个品系 感光细胞计数：H&E染色后计数外核层细胞核数量 ERG评估：1月龄小鼠暗适应后记录暗视和明视ERG反应 蛋白聚集检测：PROTEOSTAT标记视网膜切片和FRET分析（DM敏感和非敏感信号） 细胞凋亡检测：TUNEL染色与PROTEOSTAT共标记
摘要
K296E视紫红质突变导致常染色体显性遗传性视网膜色素变性。该突变的致病效应通常归因于某些研究中检测到的突变体的组成性活性。我们在此证明K296E视紫红质突变体发生聚集。聚集体包围感光细胞核并可导致细胞死亡。该过程在顶部插图中描述，下方显微图像中显示K296E突变体聚集体（红色）包围感光细胞核（蓝色）。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- K296E视紫红质突变是否通过蛋白聚集导致感光细胞死亡，以及聚集是否是视网膜色素变性的关键致病机制。
- 核心机制
- K296E突变导致视紫红质蛋白错误折叠和聚集，聚集体包围感光细胞核并触发细胞死亡，而不是主要由组成性活性引起。
- 主要证据
- RhoK296E敲入小鼠显示进行性感光细胞丢失、K296E突变体错误定位并聚集（PROTEOSTAT阳性），且PROTEOSTAT与TUNEL共标记细胞核占多数；体外FRET显示K296E突变体在小鼠和人源背景上形成聚集体，而牛源背景聚集性较低。
- 研究意义
- 研究发现K296E突变体的聚集是导致视网膜色素变性的重要因素，表明针对突变体表达的治疗策略可能有益，并有助于区分导致RP和CSNB的组成性活性突变。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
感光细胞损失的表征
量化K296E敲入小鼠中感光细胞随时间丢失的程度和速率。
对H&E染色的视网膜切片计数外核层细胞核数量，并进行ERG检查评估视功能。
视紫红质定位和聚集的检测
确定K296E突变体在感光细胞中的定位是否异常以及是否发生聚集。
使用免疫组化检测视紫红质定位，使用PROTEOSTAT标记检测蛋白聚集，并通过共聚焦显微镜观察。
聚集与细胞死亡的关系
评估PROTEOSTAT阳性聚集与感光细胞死亡（TUNEL阳性）之间的时间关联。
定量不同年龄小鼠中PROTEOSTAT和TUNEL阳性细胞核数量，并分析共标记比例。
体外FRET聚集检测
验证K296E突变在不同物种视紫红质背景下的聚集倾向，并评估突变体与WT的相互作用。
在HEK293细胞中共表达YFP和mTq2标记的野生型或突变体视紫红质，通过FRET检测DM敏感和DM非敏感信号。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证免疫效应
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 小鼠基因编辑 | Cas9核酸酶 | PNA Bio | -- |
| sgRNA | PNA Bio | -- | |
| 单链DNA替换寡核苷酸 | Integrated DNA Technologies | -- | |
| 测序 | MiSeq测序系统 | Illumina | -- |
| 组织学分析 | Axio Scan.Z1玻片扫描仪 | Carl Zeiss Microscopy | -- |
| 日立HV-F203相机 | Hitachi | -- | |
| 徕卡DME复合显微镜 | Leica Microsystems | -- | |
| EC3数字相机 | Leica Microsystems | -- | |
| 数据分析 | Prism 10 | GraphPad Software | -- |
| 电生理检查 | Celeris啮齿动物ERG系统 | Diagnosys | -- |
| 基因表达分析 | LightCycler 96实时荧光定量PCR系统 | Roche Diagnostics | -- |
| 蛋白质印迹 | Novex 4%-12% Tris-甘氨酸凝胶 | Invitrogen | -- |
| Odyssey Fc成像系统 | LI-COR Biosciences | -- | |
| anti-1D4抗体 | -- | -- | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| GNAT1抗体 | Gene Tex Inc. | GTX105960 | |
| IRDye 800CW驴抗小鼠二抗 | LI-COR Biosciences | 926-32212 | |
| IRDye 680LT驴抗兔二抗 | LI-COR Biosciences | 925-68023 | |
| 免疫组织化学 | anti-4D2抗体 | MilliporeSigma | MABN15 |
| Alexa Fluor 647山羊抗小鼠二抗 | Thermo Fisher Scientific | A21237 | |
| anti-PRPH2一抗 | Proteintech | 18109-1-AP | |
| anti-ATP1A3一抗 | Proteintech | 10868-1-AP | |
| Alexa Fluor 568山羊抗兔二抗 | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
| 凋亡检测 | 一步法TUNEL原位凋亡试剂盒 | Elabscience | E-CK-A324 |
| 蛋白聚集检测 | PROTEOSTAT聚集体检测试剂盒 | Enzo Life Sciences | -- |
| 显微镜检查 | 奥林巴斯FV1200 IX83激光扫描共聚焦显微镜 | Evident Scientific | -- |
| UPlanXApo 40x/1.40 NA油镜 | Olympus | -- | |
| UPLXAPO 100x/1.45 NA物镜 | Olympus | -- | |
| 切片封片 | DAPI Fluoromount-G封片剂 | Southern Biotech | -- |
| ProLong Glass抗淬灭封片剂（含NucBlue染料） | Invitrogen | -- | |
| 图像处理 | Huygens Essential 23.10软件 | Scientific Volume Imaging | -- |
| 图像分析 | ImageJ | -- | 版本1.53n |
| Fiji | -- | 版本2.1.0/1.53c | |
| 细胞培养与转染 | HEK293T/17细胞 | American Type Culture Collection | CRL-11268 |
| 体外聚集检测 | FluoroMax-4或FluoroMax Plus荧光分光光度计 | Horiba Jobin Yvon | -- |
| 正十二烷基-β-D-麦芽糖苷 | -- | -- | |
| 定点突变 | QuickChange II定点突变试剂盒 | Agilent Technologies | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | K296E敲入小鼠的构建：C57Bl/6J背景，CRISPR/Cas9靶向，三个品系； 阅读提示：Materials and Methods 2.1 |
| 感光细胞计数 | H&E染色切片的外核层细胞核计数方法； 阅读提示：Materials and Methods 2.2 |
| ERG | 小鼠年龄（1月龄）、暗适应条件、刺激强度范围 阅读提示：Materials and Methods 2.3 |
| 免疫组化与共聚焦 | 使用抗4D2抗体、PROTEOSTAT试剂盒、切片厚度、抗原修复步骤 阅读提示：Materials and Methods 2.5 |
| 体外FRET | HEK293T/17细胞共转染YFP和mTq2标记的视紫红质，FRET测量和DM处理 阅读提示：Materials and Methods 2.6 |