建立tet诱导型CRISPRi系统
验证在铜绿假单胞菌中可调控基因表达的系统。
构建tet诱导型CRISPRi系统，利用LuxABCDE报告基因验证表达强度，通过靶向phzM、flgK等基因验证敲低效果，并评估系统的可逆性和跨菌株适用性。
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CRISPRi筛选鉴定FprB为铜绿假单胞菌镓疗法的协同靶点
CRISPRi screen identifies FprB as a synergistic target for gallium therapy in Pseudomonas aeruginosa.
实验完整度
高包括CRISPRi-seq基因组筛选、基因敲除/敲低验证、生化活性分析、RNA-seq机制研究以及小鼠肺部感染模型等多个独立证据层级，并包含功能验证和机制验证。
主要模型
铜绿假单胞菌PA14菌株 铜绿假单胞菌PAO1菌株及ΔfprB突变株 小鼠肺部感染模型（BALB/c小鼠）
重点核对
CRISPRi-seq筛选时Ga(NO3)3浓度为200μM，预诱导14代 fprB基因敲除后，镓的MIC从320μM降至10μM FprB的FAD结合域点突变（A57G、Y58A、F72A、I74A） 小鼠感染模型中，感染剂量（2.5×10^7或1.0×10^7 CFU）及镓治疗剂量（250mM，腹腔注射）
摘要
随着耐药细菌的兴起，镓等非抗生素疗法日益受到关注。静脉注射硝酸镓正处于治疗囊性纤维化患者慢性铜绿假单胞菌感染的II期临床试验阶段。然而，其临床疗效受到人体组织可达到峰值浓度的限制。为解决这一局限，我们应用全基因组CRISPR干扰方法（CRISPRi-seq）来鉴定与镓潜在的协同靶点。我们通过响应时间和生长减少对必需基因进行分类， pinpointing 该物种中最脆弱的治疗靶点。此外，我们鉴定了一个高度保守的基因 fprB，其编码铁氧还蛋白-NADP⁺还原酶，该基因的缺失使铜绿假单胞菌对镓敏感，将其MIC降低32倍，并使其作用方式从抑菌转变为杀菌。进一步研究表明，FprB通过控制铁稳态和活性氧积累，在调节镓诱导的氧化应激中发挥关键作用。删除 fprB 增强了镓对生物膜形成的功效，并改善了铜绿假单胞菌小鼠肺部感染模型的预后，表明 FprB 是与镓联合应用的一个有前途的药物靶点。总的来说，我们的数据表明 CRISPRi-seq 是对铜绿假单胞菌进行系统遗传分析的强大工具，推进了新治疗靶点的鉴定。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 哪些基因的失活可增强镓对铜绿假单胞菌的抗菌活性，从而为镓疗法提供协同靶点？
- 核心机制
- FprB通过调控铁稳态和活性氧积累来抵抗镓诱导的氧化应激；其缺失导致细胞内铁和亚铁离子水平升高，在镓处理下通过Fenton反应加剧ROS积累，同时伴随一氧化氮水平升高和呼吸链上调，最终将镓的作用从抑菌转为杀菌。
- 主要证据
- CRISPRi-seq筛选鉴定fprB为镓敏感性基因；ΔfprB突变体在体外对镓高度敏感（MIC降低32倍），在生物膜和小鼠肺部感染模型中均增强镓的疗效；RNA-seq和生理实验证实ROS和NO积累。
- 研究意义
- 研究表明FprB是铜绿假单胞菌中保守的协同靶点，靶向FprB有望提高镓疗法的疗效，为治疗慢性铜绿假单胞菌感染提供新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建全基因组CRISPRi文库并进行必需基因鉴定
鉴定铜绿假单胞菌PA14的必需基因，并评估基因的脆弱性和响应性。
利用ccdB反选择系统高效克隆sgRNA，构建两个sgRNA文库（5981和5971个sgRNA），通过三亲本接合转入PA14，进行CRISPRi-seq筛选（7、14、21代），通过DESeq2分析确定必需基因。
化学遗传筛选镓处理下的敏感性基因
鉴定影响镓敏感性的基因，特别是那些敲低后降低细菌适应度的基因。
将CRISPRi文库用Dox预诱导14代，然后加入Ga(NO3)3（200μM）处理7代，通过CRISPRi-seq分析鉴定使细菌适应度降低的基因，包括fprB。
验证fprB及功能分析
确认fprB缺失对镓敏感性的影响，并研究其生化功能。
构建PAO1 ΔfprB突变株，检测其在不同Ga(NO3)3浓度下的生长，进行MIC测定和time-kill实验；纯化FprB蛋白，通过DCPIP实验验证其酶活性，通过AlphaFold3预测结构并引入点突变验证FAD结合域的重要性。
机制探索：铁、ROS和NO水平
阐明ΔfprB突变体对镓超敏的分子机制。
检测ΔfprB突变体在镓处理下的细胞内铁、Fe2+、ROS（H2O2）和NO水平，通过RNA-seq分析转录组变化，并通过外源补充NADPH、DMSO等验证氧化应激的作用。
评估FprB作为协同靶点的潜力
评估靶向FprB是否能在生物膜和体内模型中增强镓疗法的效果。
检测ΔfprB突变体在镓处理下的生物膜形成能力，并利用小鼠肺部感染模型评估ΔfprB菌株在镓治疗下的生存率和肺部细菌载量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
基因组筛选
生化活性检测
铁和活性氧检测
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| CRISPRi系统构建 | pJMP2846 | Addgene | 160676 |
| sgRNA克隆 | BsaI限制性内切酶 | Lablead | F5518S |
| 质粒构建 | Phanta DNA聚合酶 | Vazyme | P515-03 |
| ClonExpress Ultra一步克隆试剂盒V2 | Vazyme | C116-02 | |
| DNA纯化 | Monarch DNA纯化试剂盒 | NEB | T1030S |
| 基因组DNA提取 | FastPure细菌DNA提取迷你试剂盒 | Vazyme | DC103-01 |
| 蛋白质纯化 | 谷胱甘肽琼脂糖4B | Cytiva | 17075605 |
| RNA提取 | RNAprep Pure细胞/细菌RNA提取试剂盒 | TIANGEN | DP430 |
| NADP/NADPH检测 | NADP/NADPH-Glo™检测试剂盒 | Promega | G9081 |
| 铁含量检测 | 总铁比色检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K772-M |
| 亚铁比色检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K773-M | |
| ROS检测 | 羧基-H2DCFDA荧光探针 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| H2O2检测 | PeroxyOrange-1荧光探针 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| NO检测 | 2,3-二氨基萘 | Aladdin | D110922 |
| 细菌培养 | LB肉汤 | -- | -- |
| MIC测定 | MH肉汤 | Oxoid | CM0405 |
| 生长检测 | Tecan Spark酶标仪 | Tecan | -- |
| 流式分析 | NovoCyte Advanteon流式细胞仪 | Agilent | -- |
| FACSAria II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 质谱检测 | NexION 300× 电感耦合等离子体质谱仪 | PerkinElmer | -- |
| 超声破碎 | SCIENTZ-IID超声波破碎仪 | Scientz | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPRi-seq筛选 | 菌株：PA14；诱导剂Dox浓度：25 ng/mL；Ga(NO3)3浓度：200μM；预诱导时间：14代；筛选培养基：M9培养基；筛选阈值：|log2FC|>2；重复数：4次生物学重复 阅读提示：Methods: CRISPRi-seq Screen; Figure 3a |
| MIC测定 | 培养基：Mueller-Hinton肉汤；初始OD600：0.0015；Ga(NO3)3浓度范围：0-2560μM；培养时间：24h；温度：37°C 阅读提示：Methods: Determination of minimum inhibitory concentration of Ga(NO3)3 |
| time-kill实验 | 培养基：LB肉汤；初始OD600：0.003；Ga(NO3)3浓度：12.5-1600μM；处理时间：培养过程中多个时间点；定量方法：CFU计数 阅读提示：Methods: Gallium time-killing assay; Figure 4c |
| FprB点突变株构建与验证 | 点突变位点：A57G、Y58A、F72A、I74A；验证方式：生长曲线和斑点稀释实验；Ga(NO3)3浓度：文中未明确说明具体浓度 阅读提示：Methods: Construction of knockdown and knockout strains; Figure 4f-g |
| 小鼠肺部感染模型 | 小鼠品系：BALB/c（雌性，6-8周龄，18-22g）；感染途径：鼻内；感染剂量：2.5×10^7或1.0×10^7 CFU；治疗：250mM Ga(NO3)3腹腔注射（约160mg/kg）；治疗时间：感染后3h；终点：27h；每组n=6 阅读提示：Methods: Mouse infections; Figure 6e, g |