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        B细胞来源的孤啡肽FQ在肥胖中促进糖耐量受损和胰岛素抵抗

        B cell-derived nociceptin/orphanin FQ contributes to impaired glucose tolerance and insulin resistance in obesity.

        作者信息Stephanie C Puente-Ruiz, Leona Ide, Julia Schuller, Adel Ben-Kraiem, Anne Hoffmann, Adhideb Ghosh, Falko Noé, Christian Wolfrum, Kerstin Krause, Martin Gericke, Nora Klöting, Jens C Brüning, F Thomas Wunderlich, Matthias Blüher, Alexander Jais
        PMID40662198
        期刊iScience
        发布时间2025-06-04
        DOI10.1016/j.isci.2025.112819
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包含人类脂肪组织转录组相关性分析、B细胞特异性基因敲除小鼠模型、代谢表型测定、RNA-seq、组织学及体外N/OFQ功能实验等多个独立证据层级，并有明确的机制验证。

        主要模型

        PnocΔCD19小鼠（B细胞特异性Pnoc敲除） THP-1巨噬细胞 人内脏脂肪组织样本（LOBB队列）

        重点核对

        B细胞特异性Pnoc敲除小鼠的构建与验证 高脂饮食喂养时间及代谢表型测定时间点 N/OFQ处理浓度（1 ng/mL和10 ng/mL）及处理时间（24 h） NOP受体拮抗剂SB-612111的使用浓度（3 μM） RNA-seq差异表达基因筛选标准（log2FC>0.5，调整p<0.05）

        摘要

        免疫来源的阿片肽已被证明参与免疫调节和炎症过程。本文研究了孤啡肽FQ对肥胖中代谢功能和炎症的影响。在B细胞中选择性靶向由Pnoc基因编码的N/OFQ，可减轻饮食诱导肥胖的不利代谢效应，并增强胰岛素敏感性和葡萄糖耐量。值得注意的是，B细胞特异性Pnoc基因敲除小鼠的免疫细胞迁移标志物显著减少，脂肪组织和肝脏中的巨噬细胞募集减少。机制上，我们确定N/OFQ促进巨噬细胞募集和代谢性炎症，加剧肥胖期间的葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗。总之，N/OFQ-NOP系统所表现出的免疫调节特性使其成为减轻代谢性炎症的有前景的治疗靶点。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        B细胞来源的N/OFQ是否通过调节免疫细胞功能影响肥胖相关的代谢紊乱？
        核心机制
        N/OFQ通过NOP受体促进巨噬细胞迁移和代谢性炎症，从而加剧肥胖相关的糖耐量受损和胰岛素抵抗。
        主要证据
        B细胞特异性Pnoc敲除小鼠在高脂饮食下表现出改善的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性，伴随肝脏和脂肪组织中巨噬细胞浸润减少；体外实验显示N/OFQ诱导THP-1巨噬细胞迁移并增强其生物能量代谢，该效应被NOP受体拮抗剂SB-612111逆转。
        研究意义
        N/OFQ-NOP系统作为免疫调节靶点，可能为减轻肥胖相关代谢性炎症提供新的治疗策略。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        人类脂肪组织PNOC表达与B细胞标志物的相关性分析

        探究PNOC在人类内脏脂肪组织中的表达与B细胞标志物的关联

        利用LOBB队列的1,480例内脏脂肪组织RNA-seq数据，分析PNOC与CD19、MS4A1、CD79A、CR2等B细胞标志物的相关性，以及与巨噬细胞标志物和代谢参数的相关性。

        2

        构建B细胞特异性Pnoc敲除小鼠并验证

        验证Pnoc在B细胞中的条件性敲除是否成功

        利用Pnocfl/fl小鼠与Cd19-Cre转基因小鼠杂交获得PnocΔCD19小鼠，通过PCR和qPCR验证重组等位基因和Pnoc mRNA表达水平，并测量脾脏形态。

        3

        代谢表型分析（常规饮食和高脂饮食）

        评估B细胞特异性Pnoc敲除对基础代谢和饮食诱导肥胖的影响

        对PnocΔCD19和对照小鼠进行常规饮食或高脂饮食喂养，测定体重、脂肪量、食物摄入、活动量、能量消耗、血糖、胰岛素水平，并进行GTT和ITT。

        4

        组织学分析和免疫组化

        评估肝脏和脂肪组织的形态学变化和巨噬细胞浸润

        对HFD喂养的小鼠肝脏和附睾脂肪组织进行H&E染色、CD86免疫染色、MAC2和CD163免疫荧光染色，并量化脂肪细胞大小和巨噬细胞数量。

        5

        转录组分析

        鉴定由B细胞Pnoc缺失引起的肝脏和脂肪组织中的基因表达变化

        对HFD喂养的小鼠肝脏和eWAT进行RNA-seq，分析差异表达基因并进行GO和GSEA富集分析。

        6

        体外N/OFQ功能验证

        验证N/OFQ对巨噬细胞迁移和生物能量代谢的作用及其受体依赖性

        使用PMA分化的THP-1巨噬细胞，以1或10 ng/mL重组N/OFQ处理24小时，进行transwell迁移实验和Seahorse代谢分析，并用NOP拮抗剂SB-612111共处理以验证受体介导。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        基因分型PCR逆转录定量PCR
        验证细胞功能变化
        Transwell迁移实验海马XF线粒体压力测试
        验证分子表达变化
        RNA测序蛋白质印迹酶联免疫吸附测定
        验证免疫效应
        免疫组织化学免疫荧光OLINK靶向蛋白质组学
        评估体内效果
        葡萄糖耐量试验胰岛素耐量试验间接测热法核磁共振
        数据分析与统计
        斯皮尔曼相关基因集富集分析

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        细胞培养RPMI 1640培养基GibcoA1049101
        胎牛血清SigmaF7524
        青霉素/链霉素VWRSIALP4333
        胰蛋白酶-EDTA (0.25%)，含酚红Thermo Fisher Scientific25200056
        细胞分化佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯SigmaP8139
        红细胞裂解红细胞裂解液Invitrogen00-4333-57
        Seahorse分析Seahorse XF校准液Agilent00840-000
        D-(+)-葡萄糖溶液，45%SigmaG8769
        L-谷氨酰胺溶液 (200 mM)SigmaG7513
        Seahorse XF基础培养基Agilent102353-100
        细胞染色DAPI核酸染色液Sigma-AldrichD9542
        qPCRLow ROX SYBR 2X MasterMix blue dTTPEurogentecUF-LSMT-B0701
        Seahorse分析CellTak细胞黏附剂Corning354240
        蛋白质提取RIPA裂解液ThermoFisher89901
        蛋白酶抑制剂混合物 (100X)Cell Signaling Technology5871S
        蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物 (100X)Cell Signaling Technology5872S
        Western blotWestern blot膜，硝酸纤维素，0.2 μmMerck10600053
        蛋白质定量Pierce BCA蛋白测定试剂盒Thermo Fisher Scientific23227
        Western blot检测Pierce ECL Western blot底物VWRPIER32109
        ELISAN/OFQ ELISA试剂盒ElabscienceE-EL-M0862
        超敏小鼠胰岛素ELISA试剂盒Crystal Chem90080
        小鼠瘦素ELISA试剂盒Crystal Chem90030
        Seahorse分析Seahorse XF线粒体压力测试试剂盒Agilent103015-100
        细胞分选Pan B细胞分离试剂盒Miltenyi Biotec130-121-301
        RNA提取RNeasy脂质组织试剂盒Qiagen74804
        cDNA合成High-Capacity cDNA逆转录试剂盒Life Technologies4368814
        免疫组化HRP/DAB检测免疫组化试剂盒Abcamab64264b
        肝脏甘油三酯测定甘油三酯测定试剂盒Abcamab65336
        Seahorse分析Seahorse XFe96 FluxPakAgilent102416-100
        RNA提取RNeasy小量试剂盒Qiagen5001329
        Transwell迁移实验Corning FluoroBlok 24孔板插入式小室VWR734-0371
        Millicell 24孔板 (8.0 μm孔径)MerckPSET010
        免疫荧光TrueBlack脂褐素自发荧光淬灭剂Biotium23007
        蛋白质组学Olink Target 48小鼠试剂盒Olink93400
        免疫组化MAC-2和Gal-3（半乳糖凝集素-3）单克隆抗体，未偶联，克隆m3/38CedarlaneCL8942AP
        CD86抗体Cell Signaling Technology19589
        免疫荧光CD163抗体Abcamab182422
        Perilipin抗体Abcamab61682
        驴抗大鼠IgG (H+L)交叉吸附二抗，DyLight™ 488InvitrogenSA5-10026
        驴抗山羊IgG (H+L)交叉吸附二抗，Alexa Fluor™ 647InvitrogenA21447
        Cy3-AffiniPure驴抗兔IgG (H+L)Jackson711-165-152
        Western blotCalnexin抗体Cell Signaling Technology2433S
        OXPHOS人WB抗体混合物Abcamab110411
        抗兔IgG，HRP连接抗体Cell Signaling Technology7074
        抗鼠IgG，HRP连接抗体Cell Signaling Technology7076
        药物处理SB-612111MerckSML0571
        重组N/OFQBio-Techne, Tocris0910
        脂多糖SigmaL2630
        封闭牛血清白蛋白，无脂肪酸SigmaA8806
        胰岛素耐量试验优泌林 100U/mlEli Lilly and Company02526396
        细胞系THP-1细胞系ATCCTIB-202
        动物实验C57BL6/NTac小鼠Taconic--
        B6.129P2(C)-Cd19tm1(cre)Cgn/J小鼠Charles River--
        饮食维持饲料 (NCD)Ssniff SpezialdiätenV1534-000
        高脂饮食，60 kJ%脂肪 (HFD)Ssniff SpezialdiätenE15742-34
        qPCRMm-Hprt探针Thermo Fisher ScientificMm03024075_m1
        Mm-Tbp探针Thermo Fisher ScientificMm01277042_m1
        Mm-Pnoc (3–4)探针Thermo Fisher ScientificMm00803087_m1
        Mm-Adgre1探针Thermo Fisher ScientificMm00802529_m1
        Mm-Arg1探针Thermo Fisher ScientificMm00475988_m1
        Mm-Nos2探针Thermo Fisher ScientificMm00440502_m1
        显微镜Keyence显微镜 (BZ-X800)KeyenceBZ-X800
        细胞计数CellDrop BF细胞计数仪DeNovix--
        Seahorse分析Seahorse XFe96分析仪Agilent--
        qPCRQuantStudio 7 Flex实时荧光定量PCR系统Applied Biosystems--
        RNA测序Bioanalyzer 2100生物分析仪Agilent Technologies--
        Illumina NovaSeq X Plus测序仪Illumina--
        蛋白印迹成像G BOX成像系统Syngene--
        组织学Roti-Mount封片剂Carl Roth--
        免疫荧光Retriever 2100抗原修复仪Prestige Medical210045
        LSM980激光共聚焦显微镜Zeiss--
        体成分分析Bruker Minispec LF50时域核磁共振仪Bruker--
        血糖监测Contour Ascensia血糖仪Bayer HealthCare--
        代谢分析PhenoMaster代谢笼系统TSE Systems--
        肝脏甘油三酯测定Tecan Infinite M Plex酶标仪Tecan30190085
        ELISAFlexstation 3酶标仪Molecular Devices--
        B细胞分离gentleMACS组织解离器Miltenyi Biotec--
        MACS分选器Miltenyi Biotec--

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        动物模型
        PnocΔCD19小鼠的遗传背景（C57BL/6NTac）、Cre重组酶表达（Cd19-Cre）和对照选择（Pnocwt/wt::Cd19Cretg/wt）
        阅读提示：STAR Methods中'PnocΔCD19 mice'和'Animal husbandry'部分
        高脂饮食诱导
        饮食类型（60% kcal脂肪, E15742-34）、开始周龄（8周龄）、喂养持续时间（16周）及体重和脂肪量监测
        阅读提示：STAR Methods中'Experimental diets'和'Metabolic profiling'部分
        代谢表型测定
        GTT和ITT的实验条件（禁食时间、葡萄糖/胰岛素剂量、测量时间点）、血糖和胰岛素测定方法
        阅读提示：STAR Methods中'Glucose tolerance tests'和'Insulin tolerance tests'
        组织分析
        肝脏和脂肪组织的组织学染色、免疫组化和免疫荧光条件（抗体浓度、抗原修复方法）
        阅读提示：STAR Methods中'Histological analysis', 'Immunohistochemistry'
        体外N/OFQ实验
        THP-1分化条件（PMA浓度、时间）、N/OFQ浓度（1、10 ng/mL）和孵育时间（24h）、NOP拮抗剂SB-612111浓度（3 μM）
        阅读提示：STAR Methods中'THP-1 cells', 'Transwell migration assay', 'Seahorse XF96 mito stress test'
        RNA-seq分析
        样本数、差异表达基因筛选标准（log2FC>0.5，调整p<0.05）、参考基因组和比对软件
        阅读提示：STAR Methods中'RNA sequencing analysis'

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