单细胞转录组图谱构建
鉴定IBC与非IBC及正常组织的细胞类型和异质性。
对18例活检样本（3例IBC、13例非IBC、2例正常乳腺组织）进行scRNA-seq，经质量控制和聚类分析，鉴定出8种主要细胞类型及T细胞和上皮细胞亚群。
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单细胞和空间转录组分析揭示炎症性乳腺癌的细胞异质性和免疫抑制性肿瘤微环境。
Single-cell and spatial transcriptome profiling identifies cellular heterogeneity and immunosuppressive tumor microenvironment in inflammatory breast cancer.
实验完整度
高包含scRNA-seq、空间转录组、体外共培养、体内动物实验及天然产物筛选等多个独立证据层级，并包含功能验证和机制验证。
主要模型
4T1小鼠乳腺癌细胞系（体内原位移植瘤模型） RAW264.7小鼠巨噬细胞系 KPL-4和SUM149PT人炎症性乳腺癌细胞系
重点核对
IBC与非IBC样本的分子亚型匹配（如IBC1与LBBC、IBC2与LABC） CXCL13在4T1细胞中的过表达及其与T细胞或RAW264.7巨噬细胞共培养的时间（24小时） 体内实验中4T1-luc细胞接种数量（5×10^5）及小鼠品系（6-8周龄雌性BALB/c） anti-PD-1给药剂量（200 μg）和频率（每3天一次） 重组小鼠CXCL13给药剂量（5 μg/只）和频率（每2天一次）
摘要
炎症性乳腺癌（IBC）是一种高度侵袭性的乳腺癌亚型，预后不良。更好地了解IBC的病理和分子基础对于制定精准医疗策略至关重要。本研究旨在从单细胞和空间水平对IBC进行特征分析，以检查免疫细胞群体、信号通路，并确定治疗IBC的潜在治疗靶点。采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）来鉴定IBC和非IBC样本之间的免疫相关差异。利用qRT-PCR和荧光染色验证scRNA-seq的发现，同时使用NanoString GeoMx数字空间谱分析仪进行空间分析以评估免疫细胞浸润。进行肿瘤-免疫细胞共培养实验以评估CXCL13的细胞毒性作用。进行体内研究以评估CXCL13对免疫治疗疗效的影响。此外，进行了天然产物筛选以确定治疗IBC的潜在免疫调节剂。scRNA-seq显示IBC肿瘤微环境中T细胞中CXCL13表达显著降低，这一发现与较差的患者预后相关。此外，免疫相关基因组显著下调，细胞间相互作用减弱，表明IBC内存在免疫抑制状态。空间分析进一步证明IBC肿瘤组织内CD45阳性免疫细胞的存在减少，突出了这种侵袭性癌症亚型所特有的免疫浸润受损。最重要的是，在肿瘤细胞中过表达CXCL13，与免疫细胞共培养时，显著促进了肿瘤细胞死亡。CXCL13还可以在体内增强抗PD-1疗法的疗效。此外，天然产物筛选确定血根碱和α-倒捻子素为潜在的免疫调节化合物，为调节IBC中的免疫反应和改善治疗结果提供了有前景的治疗途径。我们的研究结果揭示了IBC“冷”肿瘤微环境内的固有异质性。这些因素共同促成了IBC特有的免疫抑制。此外，天然产物筛选确定血根碱和α-倒捻子素为有前景的免疫调节剂，为改善治疗结果提供了潜在的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 炎症性乳腺癌（IBC）在单细胞和空间水平上具有怎样的细胞异质性和免疫微环境特征，以及哪些潜在治疗靶点可用于治疗IBC？
- 核心机制
- IBC肿瘤微环境中CXCL13下调，导致免疫细胞招募受损和T细胞活性降低，CXCL13-CXCR3轴信号减弱，形成免疫抑制的“冷”肿瘤微环境。
- 主要证据
- scRNA-seq显示IBC中T细胞CXCL13表达降低，免疫相关基因下调，细胞互作减弱；空间分析显示CD45阳性免疫细胞减少；体外过表达CXCL13促进肿瘤细胞死亡；体内联合CXCL13增强抗PD-1疗效；天然产物筛选鉴定出血根碱和α-倒捻子素上调炎症基因表达。
- 研究意义
- 揭示IBC“冷”肿瘤微环境的免疫抑制机制，并为IBC治疗提供了潜在的免疫调节策略（如CXCL13和天然产物）。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
T细胞亚群及CXCL13表达分析
比较IBC与非IBC中T细胞亚群组成及CXCL13表达差异。
对T细胞进行亚群分析，鉴定14个亚群；比较亚群比例，发现IBC中CXCL13+ CD4+ T细胞（耗竭T细胞）比例降低；通过Kaplan-Meier生存分析评估CXCL13与预后的关系。
差异表达及免疫浸润分析
验证CXCL13下调与免疫抑制及免疫浸润的关系。
分析T细胞DEGs，显示CXCL13、GZMB、GNLY、IFITM1下调；通过GEPIA、Sangerbox等公共数据库分析CXCL13与免疫浸润的相关性；用GeoMx DSP空间分析评估IBC与非IBC的免疫细胞浸润。
细胞间通讯分析
比较IBC与非IBC中细胞间配体-受体相互作用。
使用CellChat分析细胞通讯，发现IBC中CXCL13-CXCR3轴信号减弱，MIF信号增强，ANXA1-FPR1信号上调。
体外共培养功能验证
验证CXCL13过表达对免疫细胞杀伤肿瘤细胞的影响。
将正常或过表达CXCL13的4T1细胞与T细胞或RAW264.7巨噬细胞共培养，检测肿瘤细胞凋亡、细胞因子分泌、巨噬细胞极化和吞噬作用。
体内联合治疗实验
评估CXCL13能否增强抗PD-1疗法在体内的疗效。
在BALB/c小鼠中建立4T1-luc原位肿瘤模型，分别给予抗PD-1单药或联合重组鼠CXCL13治疗，监测肿瘤体积、荧光强度和体重。
天然产物筛选
鉴定对IBC细胞有抑制作用的潜在免疫调节剂。
利用CCK-8法筛选910种天然产物对7种细胞系的抑制作用，选择对IBC细胞抑制显著的化合物，通过qRT-PCR检测其对炎症基因（HLA-A、FLNA、CXCL13）表达的影响，并验证α-倒捻子素与巨噬细胞共培养的细胞毒作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
单细胞转录组测序与分析
空间转录组分析
药物筛选
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 共培养实验 | EasySep™ T细胞分离试剂盒 | STEMCELL | 19851 |
| 小鼠CD3/CD28 T细胞激活磁珠 | Elabscience | MIM001A | |
| 白细胞介素-2 | MCE | HY-P7077 | |
| ELISA | TNF-α ELISA试剂盒 | CZKEWEI | SU-BN20852 |
| 颗粒酶B ELISA试剂盒 | CZKEWEI | SU-BN20140 | |
| IFN-γ ELISA试剂盒 | CZKEWEI | SU-BN20455 | |
| 吞噬实验 | Dil荧光染料 | YEASEN | 40726ES10 |
| Cellhunt Green CMFDA荧光染料 | Aladdin | 136832-63-8 | |
| 流式细胞术 | 抗CD86抗体 | -- | -- |
| 抗CD206抗体 | -- | -- | |
| 免疫荧光染色 | 抗CXCL13/BCA1抗体 | -- | -- |
| 抗MHC I类抗体 | -- | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| 空间转录组 | SYTO13核酸染料 | -- | -- |
| 广谱细胞角蛋白 | -- | -- | |
| CD45 | -- | -- | |
| 体内实验 | 抗小鼠PD-1抗体 | -- | -- |
| 重组小鼠CXCL13 | -- | -- | |
| 药物筛选 | α-倒捻子素 | -- | -- |
| 血根碱 | -- | -- | |
| 穿心莲内酯 | -- | -- | |
| 小白菊内酯 | -- | -- | |
| 薯蓣皂苷 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本收集 | 样本类型（IBC、非IBC、正常）及分子亚型（ER、PR、HER2、Ki67） 阅读提示：Materials and methods: Clinical samples collection |
| scRNA-seq | 样本处理流程、测序平台、数据质控标准 阅读提示：Materials and methods: Single-cell RNA-sequencing |
| 共培养实验 | 共培养时间（24小时）、细胞比例（4T1与T细胞/巨噬细胞）、效应细胞（T细胞、RAW264.7） 阅读提示：Materials and methods: Co-culture experiments |
| 体内实验 | 小鼠品系（BALB/c）、周龄（6-8周）、性别（雌性）、细胞接种量（5×10^5）、治疗剂量和频率 阅读提示：Materials and methods: In vivo experiments |
| 细胞系培养 | 细胞系来源及培养条件（培养基、血清浓度、CO2浓度） 阅读提示：Materials and methods: Cell culture |
| 天然产物筛选 | 筛选浓度、处理时间、细胞系（MCF-10A、MCF-7等） 阅读提示：Results: Sanguinarine and α-mangostin...及Supplementary Fig. S7 |