建立银屑病细胞模型
模拟银屑病皮肤炎症微环境，确定TNF-α刺激浓度。
用不同浓度TNF-α处理HaCaT细胞，检测细胞活力和炎症因子表达，选用100 μg/L TNF-α处理24 h。
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含有长链非编码RNA AGAP2-AS1的外泌体通过miR-424-5p/SGK1轴促进银屑病中CD4+ T细胞的分化
Exosomes containing long non-coding RNA AGAP2-AS1 promote the differentiation of CD4+ T cells through the miR-424-5p/SGK1 axis in psoriasis.
实验完整度
高包含体外细胞模型（TNF-α处理HaCaT）、外泌体表征、功能验证（流式、ELISA）、机制验证（双荧光素酶、Western blot、qPCR）及患者CD4+ T细胞分离，多重证据层级。
主要模型
HaCaT细胞（人永生化角质形成细胞系） 健康人外周血CD4+ T细胞 HEK-293T细胞
重点核对
TNF-α处理HaCaT细胞浓度（100 μg/L） 外泌体提取和表征方法（TEM、NTA、Western blot） CD4+ T细胞分离方法（Ficoll密度梯度离心和Miltenyi磁珠） CD4+ T细胞培养条件（T细胞特异性培养基、CD3/CD28激活剂、IL-2） 转染试剂（CALNP RNAi体外）
摘要
背景：长链非编码RNA（lncRNAs）已被涉及自身免疫性疾病的发病机制。我们既往的研究表明，角质形成细胞中的AGAP2-AS1参与银屑病的发病，但其对CD4+ T细胞分化的影响仍不清楚。方法：使用试剂盒从HaCaT细胞中提取外泌体，并通过TEM（透射电子显微镜）、NTA（纳米颗粒追踪分析）和Western Blot进行验证。我们将外泌体与CD4+ T细胞共孵育，并通过荧光显微镜检测AGAP2-AS1的分布。流式细胞术和ELISA用于检测CD4+ T细胞分化。此外，通过生物信息学分析、双荧光素酶报告基因实验、实时荧光定量PCR、流式细胞术和ELISA证实了AGAP2-AS1/miR-424-5p/SGK1之间的关系及其对CD4+ T细胞分化的影响。结果：我们发现，来源于TNF-α处理的HaCaT细胞的外泌体能够将AGAP2-AS1递送至CD4+ T细胞，促进Th1和Th17分化。在CD4+ T细胞中，AGAP2-AS1通过miR-424-5p/SGK1轴促进Th1和Th17分化。结论：银屑病HaCaT细胞通过外泌体将AGAP2-AS1递送至CD4+ T细胞，通过miR-424-5p/SGK1轴诱导Th1和Th17分化，从而促进银屑病的进展。这些发现为银屑病的发病机制和潜在治疗靶点提供了新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 银屑病中表皮细胞如何通过外泌体与CD4+ T细胞相互作用，影响其分化？
- 核心机制
- TNF-α处理的HaCaT细胞来源外泌体递送AGAP2-AS1，AGAP2-AS1作为miR-424-5p的分子海绵，上调SGK1表达，通过miR-424-5p/SGK1轴促进CD4+ T细胞向Th1和Th17分化。
- 主要证据
- 体外共培养实验显示TNF-α处理HaCaT来源外泌体上调Th1/Th17比例（流式）及IFN-γ、IL-17A分泌（ELISA）；双荧光素酶实验证实AGAP2-AS1与miR-424-5p、miR-424-5p与SGK1结合；rescue实验显示miR-424-5p mimics和siSGK1逆转AGAP2-AS1效应。
- 研究意义
- 揭示银屑病中表皮细胞通过外泌体传递lncRNA调节CD4+ T细胞分化的新机制，为通过调节lncRNA实现CD4+ T细胞分化可塑性提供新策略，作为银屑病潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
外泌体提取与表征
纯化和验证HaCaT细胞来源的外泌体。
使用Exosome Extraction and Purification Kit提取外泌体，通过TEM观察形态，NTA测量粒径，Western blot检测标志物CD63、TSG101，并排除Calnexin污染。
外泌体摄取实验
验证CD4+ T细胞是否能摄取HaCaT来源的外泌体。
用PKH67标记外泌体，与CD4+ T细胞共培养，荧光显微镜观察。
外泌体对CD4+ T细胞分化的功能验证
评估TNF-α处理HaCaT来源外泌体对CD4+ T细胞分化的影响。
将CD4+ T细胞与外泌体共培养5天，流式细胞术检测Th1和Th17细胞比例，ELISA检测IFN-γ和IL-17A分泌水平，qPCR检测T-bet和RORγt mRNA表达。
AGAP2-AS1功能验证
验证AGAP2-AS1是否介导外泌体对CD4+ T细胞分化的影响。
将AGAP2-AS1的慢病毒载体（LV-AGAP2-AS1）或空载体（LV-NC）转染CD4+ T细胞，检测Th1/Th17比例和细胞因子蛋白水平。
AGAP2-AS1与miR-424-5p的靶向关系验证
验证AGAP2-AS1作为miR-424-5p的分子海绵。
利用TargetScan预测结合位点，构建野生型和突变型AGAP2-AS1载体，在HEK-293T细胞中进行双荧光素酶报告实验，并检测miR-424-5p过表达或抑制对AGAP2-AS1表达的影响。
SGK1作为miR-424-5p靶基因验证
验证SGK1是miR-424-5p的直接靶基因。
使用多个数据库预测靶基因，构建SGK1-WT和SGK1-MUT载体，进行双荧光素酶报告实验，并检测miR-424-5p对SGK1表达的影响。
AGAP2-AS1/miR-424-5p/SGK1轴救回实验
验证AGAP2-AS1通过miR-424-5p/SGK1轴促进CD4+ T细胞分化。
在CD4+ T细胞中过表达AGAP2-AS1，同时加入miR-424-5p mimics或siSGK1，检测Th1/Th17比例和细胞因子水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| T细胞专用培养基 | STEMCELL | 10981 | |
| 人CD3/CD28 T细胞激活剂 | STEMCELL | 10971 | |
| 重组人IL-2 | STEMCELL | 78220 | |
| 外泌体提取 | 外泌体提取纯化试剂盒 | Umibio | UR52121 |
| 外泌体标记 | PKH67荧光染料 | Umibo | UR52303 |
| 细胞培养 | Ficoll分离液 | -- | -- |
| CD4+ T细胞分离 | CD4+ T细胞分选试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-096-533 |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | Dojindo Laboratories | GK10001 |
| 流式细胞术 | 细胞刺激混合物 | Elabscience | E-CK-A091 |
| 蛋白转运抑制剂混合物 | Elabscience | E-CK-A091 | |
| 细胞染色缓冲液 | Elabscience | E-CK-A107 | |
| 抗人CD4抗体 | eBioscience | 17-0049-42 | |
| 固定缓冲液 | Elabscience | E-CK-A109 | |
| 抗人IFN-γ抗体 | Elabscience | E-AB-F1196C | |
| 抗人IL-17A抗体 | Elabscience | E-AB-F1173D | |
| Western blot | RIPA裂解液 | BIOTEK | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| SGK1一抗 | UpingBio Technology Co., Ltd. | -- | |
| CD63一抗 | -- | #52090 | |
| TSG101一抗 | -- | Ab125011 | |
| Calnexin一抗 | -- | #2433 | |
| GAPDH一抗 | Cell Signaling Technology | -- | |
| ELISA | IFN-γ ELISA试剂盒 | -- | E-EL-H0108c |
| IL-17A ELISA试剂盒 | -- | E-EL-H5812c | |
| 细胞转染 | CALNP体外RNAi转染试剂 | -- | -- |
| 过表达AGAP2-AS1慢病毒 | Genechem | -- | |
| RNA提取 | 总RNA提取试剂盒 | Foregene | -- |
| RT-qPCR | PrimeScript逆转录试剂盒 | Takara | RR036A |
| SYBR Premix Ex Taq试剂盒 | Takara | RR820A | |
| 双荧光素酶报告 | psiCHECK-2荧光素酶报告载体 | Shuangquan Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 双荧光素酶报告检测系统 | Beyotime | RG088S | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 10.1软件 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | HaCaT细胞培养基（DMEM+10%FBS）、CD4+ T细胞培养基（T cell-specific medium, STEMCELL, 10981）、激活剂（CD3/CD28, 25 μL/mL）、IL-2浓度10 ng/mL、培养条件37°C、5% CO2 阅读提示：Methods section 2.1 Cell culture and cell treatment |
| TNF-α处理 | TNF-α浓度100 μg/L、处理时间24 h、细胞密度70%-80% 阅读提示：Methods section 2.1 Cell culture and cell treatment; Results 3.1 |
| 外泌体提取 | 外泌体提取试剂盒（UR52121, Umibio） 阅读提示：Methods section 2.4 Isolation and characterization of exosome |
| CD4+ T细胞分离 | Ficoll密度梯度离心、Miltenyi磁珠（130-096-533） 阅读提示：Methods section 2.2 Patients' cell isolation |
| 共培养 | 外泌体与CD4+ T细胞共培养5天 阅读提示：Methods section 2.1 Cell culture and cell treatment; Results 3.2 |
| 流式细胞术 | 细胞刺激混合物处理时间（0.5-1 h）、蛋白转运抑制剂处理（5-6 h）、抗体（CD4-17-0049-42, IFN-γ-E-AB-F1196C, IL-17A-E-AB-F1173D） 阅读提示：Methods section 2.6 Flow cytometry |
| RT-qPCR | 逆转录试剂盒（RR036A, Takara）、SYBR Premix Ex Taq（RR820A, Takara）、内参GAPDH或U6 阅读提示：Methods section 2.10 RNA extraction and quantitative real-time |
| 双荧光素酶报告 | HEK-293T细胞密度5×10^3 cells/well、转染试剂Lipofectamine 3000、检测试剂盒（RG088S, Beyotime） 阅读提示：Methods section 2.11 Dual-luciferase reporter assay |