临床样本与动物模型验证焦亡激活
验证在肾结石患者和小鼠模型中，GSDMD介导的焦亡是否被激活及其与疾病严重程度的关系。
收集肾结石患者和正常人的肾组织及血液样本，检测焦亡相关基因和蛋白表达；建立Gly诱导的CaOx小鼠模型，进行RNA-seq分析。
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调节GSDMD介导的细胞焦亡与CHMP4B依赖性细胞修复之间的平衡可减轻草酸钙肾结石的形成
Regulating the balance between GSDMD-mediated pyroptosis and CHMP4B-dependent cell repair attenuates calcium oxalate kidney stone formation.
实验完整度
高包含临床样本分析、细胞模型、动物模型及RNA-seq等多层级验证，并明确进行功能获得与缺失实验及机制研究。
主要模型
人肾小管上皮细胞系HK-2 C57BL/6小鼠乙醛酸盐诱导的草酸钙肾结石模型 GSDMD基因敲除小鼠 肾结石患者和健康对照的肾组织和血液样本
重点核对
HK-2细胞使用0.8 mmol/L草酸盐处理24小时 NSA（GSDMD抑制剂）使用浓度：体外15 μmol/L，体内50 mg/kg/d腹腔注射 乙醛酸盐体内造模剂量：100 mg/kg/d腹腔注射，连续7天 AAV-FLEX-CHMP4B通过尾静脉注射（80 mg/kg，100 μL），注射后2周开始造模 体内实验中每组小鼠数量为6只
摘要
在肾结石疾病中，肾小管上皮细胞（RTECs）的损伤与修复之间存在失衡，但其潜在机制在很大程度上仍不清楚。在此，我们发现GSDMD介导的细胞焦亡发生在草酸钙（CaOx）肾结石患者和小鼠中，且NOD样受体蛋白3（NLRP3）和GSDMD的表达水平与肾结石的严重程度相关。GSDMD缺乏可减轻肾小管损伤和炎症反应，最终抑制肾损伤和晶体沉积。此外，我们发现带电荷的多泡体蛋白4B（CHMP4B）依赖性细胞修复在RTECs焦亡过程中被激活；然而，增强程度不足以抵消损伤。重要的是，焦亡过程中的Ca2+流诱导CHMP4B依赖性细胞修复机制的激活。CHMP4B的过表达可减轻细胞死亡并降低肾结石的严重程度。值得注意的是，将CHMP4B过表达与GSDMD抑制剂联合使用，在改善乙醛酸盐（Gly）诱导的肾损伤和晶体沉积方面显示出更高的疗效。综上所述，这些结果强调了GSDMD介导的焦亡与CHMP4B依赖性细胞修复之间的失衡是CaOx肾结石形成的驱动因素。我们的发现为草酸钙肾结石提供了新的见解和潜在的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肾小管上皮细胞损伤与修复失衡是否参与草酸钙肾结石形成，以及GSDMD介导的焦亡与CHMP4B依赖性修复之间的平衡机制如何？
- 核心机制
- 草酸钙激活NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路，导致GSDMD-N形成膜孔，释放IL-1β和IL-18，引起焦亡；同时细胞内Ca2+升高激活CHMP4B依赖性细胞修复，通过膜脱落修复膜孔，但修复能力不足以抵消损伤，导致损伤修复失衡，促进结石形成。
- 主要证据
- 临床样本和动物模型中焦亡蛋白及CHMP4B表达上调；GSDMD敲除或NSA抑制焦亡减轻肾损伤和晶体沉积；CHMP4B过表达促进修复并减少细胞死亡和晶体粘附；联合处理效果更显著。
- 研究意义
- 揭示了焦亡与细胞修复失衡在肾结石发病中的驱动作用，为草酸钙肾结石提供了新的治疗靶点和干预策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内外验证GSDMD敲除或抑制对损伤和结石的影响
评估GSDMD缺乏或抑制是否能减轻草酸钙诱导的细胞损伤、炎症和晶体沉积。
使用GSDMD-KO小鼠和NSA处理小鼠，检测肾功能指标（CRE、BUN）、炎症因子、肾组织病理、晶体沉积和粘附蛋白表达；在HK-2细胞中通过siRNA或NSA抑制GSDMD，检测细胞活死、LDH释放和晶体粘附。
CHMP4B表达与定位检测
研究CHMP4B在草酸钙诱导的焦亡过程中的表达变化和亚细胞定位。
通过免疫组化、Western blot和免疫荧光检测人和小鼠肾组织及HK-2细胞中CHMP4B的表达和定位，观察其与GSDMD-N的共定位。
体外CHMP4B过表达或敲低的功能验证
验证CHMP4B过表达或敲低对Ox诱导的细胞损伤、焦亡和晶体粘附的影响。
在HK-2细胞中转染oe-CHMP4B或si-CHMP4B，检测细胞骨架、LDH释放、细胞内Ca2+、细胞活死、晶体粘附及细胞膜变化。
体内CHMP4B过表达验证
评估CHMP4B过表达在小鼠体内对肾损伤、炎症和晶体沉积的保护作用。
通过尾静脉注射AAV-FLEX-CHMP4B实现肾内过表达，随后建立CaOx模型，检测肾功能、炎症因子、组织病理和转录组变化。
联合疗法验证
探究同时抑制焦亡和增强细胞修复是否能协同减轻草酸钙肾结石。
在HK-2细胞和小鼠模型中联合使用NSA和CHMP4B过表达，比较单独和联合治疗的效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 血液RNA提取 | 血液总RNA提取试剂盒 | Foregene | RE-04013 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Meilunbio | MA0212 |
| 胎牛血清 | ExCell | FSD500 | |
| 青霉素-链霉素 | Meilunbio | MA0110 | |
| 动物造模 | 乙醛酸盐 | Macklin | 563-96-2 |
| 药物处理 | 坏死磺酰胺 | Abcam | ab143839 |
| TUNEL检测 | 一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒 | meilunbio | MA0224 |
| 含DAPI的抗淬灭封片剂 | meilunbio | MA0236 | |
| 细胞-晶体粘附 | 草酸钠 | Solarbio | D6830 |
| 氯化钙 | Solarbio | C7250 | |
| siRNA转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 磷酸酶抑制剂 | Glpbio | GK10012 | |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Yamei | ZJ102 |
| 4× SDS-PAGE上样缓冲液 | Solarbio | P1016 | |
| PVDF膜 | Solarbio | ISEQ0001 | |
| 脱脂奶粉 | Solarbio | D8340 | |
| ECL检测试剂盒 | Elabscience | E-IR-R308 | |
| Tanon-5200成像系统 | Tanon | 5200 | |
| RNA提取 | Trizol替代物 | Solarbio | R1100 |
| qRT-PCR | cDNA合成预混液 | Yeasen | 11141ES60 |
| SYBR Green预混液 | Yeasen | 11201ES08 | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | -- | -- |
| 正常山羊血清 | -- | -- | |
| Alexa Fluor 594山羊抗兔二抗 | Invitrogen | A-11012 | |
| Alexa Fluor 488山羊抗小鼠二抗 | Invitrogen | A-11001 | |
| DAPI染料 | Solarbio | C0065 | |
| 免疫组化 | Tris-EDTA缓冲液 | Solarbio | C1038 |
| PV-9000两步法免疫组化试剂盒 | ZSGB-BIO | PV-9000 | |
| DAB显色试剂盒 | Solarbio | DA1010 | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Glpbio | GK10001 |
| ELISA | IL-1β ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0037 |
| IL-18 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0730 | |
| 细胞内Ca2+检测 | Fluo-4钙离子检测试剂盒 | Beyotime | S1061S |
| 细胞膜染色 | Dil细胞膜染色试剂盒 | Beyotime | C1991S |
| 细胞核染色 | Hoechst 33342染料 | Solarbio | C0030 |
| 活死细胞染色 | Calcein-AM/PI双染试剂盒 | Elabscience | E-CK-A354 |
| 透射电镜 | 电镜固定液 | Servicebio | G1102 |
| 醋酸铀 | -- | -- | |
| 柠檬酸铅 | -- | -- | |
| RNA测序 | RNA 6000 Nano试剂盒 | Agilent | -- |
| Illumina NovaSeq 6000测序系统 | Illumina | 6000 | |
| 荧光显微镜 | 荧光显微镜 | Nikon | -- |
| 酶标仪 | 800TS酶标仪 | BIOTEK | 800TS |
| 透射电镜 | 透射电子显微镜HT7700 | Hitachi | HT7700 |
| 组织成像 | Nikon Eclipse Ci显微镜 | Nikon | Ci |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 小鼠品系（C57BL/6）、性别（雄性）、年龄（6-8周）、体重？；乙醛酸盐剂量（100 mg/kg/d）、给药途径（腹腔注射）、给药时间（7天）；对照组给予等量生理盐水 阅读提示：Materials and Methods: Animal experiments |
| 细胞培养和处理 | HK-2细胞培养条件（DMEM+10%FBS+1%青霉素-链霉素，5% CO2，37°C）；Ox处理浓度（0.8 mmol/L）、时间（24小时）；NSA浓度（15 μmol/L）；siRNA和质粒转染方法（Lipofectamine 3000）及转染时间 阅读提示：Materials and Methods: Cell culture and intervention; siRNA transfection and plasmid transfection |
| GSDMD敲除或抑制 | GSDMD-KO小鼠的基因型确认；NSA给药剂量（50 mg/kg/d）和途径（腹腔注射）；siRNA序列（si-GSDMD）及转染效率验证 阅读提示：Materials and Methods: Animal experiments; siRNA transfection; Results: GSDMD deficiency...; Figure legends |
| CHMP4B过表达 | AAV-FLEX-CHMP4B注射剂量（80 mg/kg, 100 μL）、途径（尾静脉）、时间（造模前2周）；体外oe-CHMP4B质粒转染条件；CHMP4B表达验证方法 阅读提示：Materials and Methods: Animal experiments; Cell culture; Results: CHMP4B overexpression... |
| 联合治疗 | NSA和AAV-CHMP4B联合使用的剂量、时间和顺序；与单独治疗的比较 阅读提示：Materials and Methods: Animal experiments; Results: Maintaining the balance... |
| 检测指标 | 肾功能指标（CRE、BUN）、炎症因子（IL-1β、IL-18）的检测方法；晶体沉积（Von Kossa染色）、细胞死亡（TUNEL、Calcein-AM/PI）、细胞粘附（COM晶体粘附）、蛋白表达（Western blot）的具体步骤和定量方法 阅读提示：Materials and Methods: 相应检测方法部分; Figure legends |