单细胞转录组测序分析
鉴定与B-ALL进展相关的关键基因
对9个样本（3例RR、3例ND、3例HD）进行10x单细胞转录组测序，通过UMAP聚类和差异表达分析，筛选在祖B细胞亚群中与疾病进展相关的共同差异表达基因（包括UHRF1）。
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UHRF1介导的表观遗传重编程调控糖酵解促进B细胞急性淋巴细胞白血病的进展
UHRF1-mediated epigenetic reprogramming regulates glycolysis to promote progression of B-cell acute lymphoblastic leukemia.
实验完整度
高包含临床样本scRNA-seq、细胞系功能实验（敲除/回补）、DNA甲基化分析（850K芯片、BSP、ChIP-qPCR）、代谢检测（ECAR、乳酸测定）及体内CDX模型验证。
主要模型
Nalm6人B-ALL细胞系 Reh人B-ALL细胞系 NOD/SCID/IL2Rγ-null (NSG)小鼠CDX模型 B-ALL患者样本
重点核对
UHRF1在RR B-ALL中的表达上调（通过RT-qPCR和Western blot验证） UHRF1敲除后细胞增殖抑制、凋亡增加及周期阻滞（MTS、流式检测） UHRF1通过DNA甲基化调控SFRP5表达（850K甲基化芯片、BSP、ChIP-qPCR） UM164抑制UHRF1活性并干扰P38磷酸化、HK2表达和乳酸产生（MST、ECAR、乳酸测定） 体内CDX模型中UM164延迟白血病进展并延长生存期（IVIS、流式、生存分析）
摘要
成人B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）的预后仍然不佳，尤其是在复发难治的情况下。探索疾病进展的分子机制对于改善临床结局具有重要前景。在本研究中，利用单细胞转录组测序技术，我们发现了含有PHD和RING指状结构域的泛素样蛋白1（UHRF1）与B-ALL进展之间的相关性。我们的研究结果显示，在复发难治性B-ALL中UHRF1显著上调，从而作为不良预后的预后指标。敲除UHRF1或其下游靶点分泌型卷曲相关蛋白5（SFRP5）的过表达均导致白血病细胞增殖受抑，促进细胞凋亡并诱导细胞周期阻滞。我们的结果表明，UHRF1利用甲基化修饰抑制SFRP5的表达，从而诱导WNT5A-P38 MAPK-HK2信号轴，导致有氧糖酵解的关键代谢产物乳酸增加。此外，我们确定UM164是UHRF1的靶向抑制剂，可显著抑制P38蛋白磷酸化，下调HK2表达并减少乳酸产生。UM164在体外和体内也显示出抗白血病活性。总之，我们的研究揭示了复发难治性B-ALL中表观遗传和代谢重编程的分子机制，并为改善其不良预后提供了潜在的靶向治疗策略。示意图模型显示了B-ALL中UHRF1-SFRP5-WNT5A-P38 MAPK-HK2的调控网络。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探讨UHRF1在B-ALL进展中的作用及其分子机制，寻找潜在治疗靶点。
- 核心机制
- UHRF1通过DNA甲基化修饰抑制SFRP5表达，解除SFRP5对WNT5A的抑制，激活WNT5A-P38 MAPK-HK2信号轴，促进有氧糖酵解和白血病进展。
- 主要证据
- scRNA-seq和RT-qPCR显示UHRF1在RR B-ALL中高表达；UHRF1敲除抑制增殖并诱导凋亡；850K甲基化芯片、BSP和ChIP-qPCR证实UHRF1调节SFRP5甲基化；功能实验验证SFRP5/WNT5A-P38 MAPK-HK2轴对糖酵解的影响；UM164在体外和体内抑制白血病进展。
- 研究意义
- 揭示UHRF1介导的表观遗传和代谢重编程在复发难治B-ALL中的机制，为改善其不良预后提供潜在靶向治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证UHRF1表达与临床相关性
验证UHRF1在B-ALL中的表达水平及其与预后的关系
收集90份B-ALL患者样本和25份健康供者样本，通过RT-qPCR和Western blot检测UHRF1表达；结合临床数据（本中心51例及TARGET数据库369例）进行生存分析。
UHRF1敲除与回补的体外功能实验
评估UHRF1对B-ALL细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响
利用CRISPR-Cas9在Nalm6和Reh细胞中敲除UHRF1，并通过回补实验恢复表达；通过MTS、流式细胞术检测细胞增殖、凋亡和细胞周期。
UHRF1调控SFRP5甲基化的机制验证
验证UHRF1通过DNA甲基化调控SFRP5表达
在Nalm6细胞中敲除UHRF1后进行RNA-seq和850K甲基化芯片分析，筛选共同差异基因；通过ChIP-qPCR验证UHRF1结合SFRP5启动子，BSP检测SFRP5启动子CpG位点甲基化状态，并检测SFRP5表达变化。
SFRP5与WNT5A相互作用验证
验证SFRP5与WNT5A蛋白的相互作用及对下游信号的影响
通过免疫荧光检测SFRP5与WNT5A的共定位，使用BLI测量结合亲和力；在B-ALL细胞中过表达SFRP5，检测对HK2表达、P38磷酸化、乳酸产生和细胞增殖的影响。
P38 MAPK-HK2轴在糖酵解中的作用验证
验证P38 MAPK信号通路调控HK2表达并影响糖酵解
使用P38抑制剂SB203580处理B-ALL细胞，检测HK2表达、乳酸水平和ECAR变化。
WNT5A抑制剂BOX5对糖酵解的影响
验证WNT5A抑制对下游P38-HK2信号及糖酵解的影响
用WNT5A抑制剂BOX5处理B-ALL细胞，检测HK2表达、P38磷酸化、乳酸水平和ECAR。
UM164靶向UHRF1的鉴定与体外活性
筛选并验证UHRF1抑制剂UM164的抗白血病活性
通过虚拟筛选从MCE化合物库中筛选候选物，使用MST验证UM164与UHRF1的结合；体外处理B-ALL细胞，检测增殖、凋亡、周期、SFRP5甲基化、HK2表达、P38磷酸化、乳酸和ECAR。
UM164体内抗白血病效果评估
评估UM164在CDX小鼠模型中的抗白血病作用
将Nalm6-Luc细胞移植入NSG小鼠建立CDX模型，给予UM164治疗，监测生存期、肿瘤负荷、白血病细胞浸润。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
细胞功能变化验证
表观遗传和甲基化分析
糖酵解和代谢检测
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 样本单核细胞分离 | 淋巴细胞分离液 | STEMCELL Technologies | 18061 |
| CD19+细胞分选 | EasySep释放人CD19阳性分选试剂盒 | STEMCELL Technologies | 17854 |
| 质粒构建与慢病毒包装 | LentiCRISPR v2质粒 | Addgene | 52961 |
| Lipofectamine 3000试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | Merck & Co., Inc. | 58-58-2 |
| 质粒构建（回补） | pCDH-CMV-MCS-EF1a-mCherry载体 | BioSune Biotechnology | -- |
| 单细胞RNA测序 | Chromium单细胞3'基因表达分析试剂盒（Gel Bead V3） | 10X Genomics | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596026 |
| 逆转录 | 逆转录试剂盒 | Promega Corporation | A5001 |
| RT-qPCR | SYBR Green Supermix | Vazyme Biotechnology | Q711-03 |
| Applied Biosystems 7500实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解液 | Shanghai Epizyme Biomedical Technology Co., China | PC101 |
| Western blot | UHRF1抗体 | ABclonal Biotechnology | A2343 |
| SFRP5抗体 | ABclonal Biotechnology | A16734 | |
| HK2抗体 | ABclonal Biotechnology | A22319 | |
| P38抗体 | Cell Signaling Technology | 8690S | |
| P-P38抗体 | Cell Signaling Technology | 4511S | |
| α-Tubulin抗体 | Jingjie PTM BioLab Co., Inc. | PTM-7176 | |
| β-actin抗体 | ABclonal Biotechnology | AC026 | |
| 增强化学发光试剂 | Thermo Fisher Scientific | 32106 | |
| ChemiDoc成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 凋亡检测 | 膜联蛋白V | BioLegend | 640920 |
| 7-AAD | BioLegend | 420404 | |
| 细胞增殖检测 | MTT | Solarbio | IM0280 |
| MTS试剂 | Promega Corporation | G3580 | |
| 细胞周期检测 | 碘化丙啶 | BD | -- |
| RNA测序 | Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | -- |
| RNA 6000 Nano芯片 | Agilent Technologies | -- | |
| NEBNext Ultra II RNA文库制备试剂盒 | New England Biolabs | E7775S | |
| DNA甲基化分析 | QIAamp DNA血液迷你试剂盒 | Qiagen | 51104 |
| EZ DNA甲基化Gold试剂盒 | Zymo Research | D5005 | |
| Illumina Infinium 850K芯片 | Illumina | -- | |
| GenomeStudio 2.0数据分析软件 | Illumina | -- | |
| Bisulfite sequencing PCR | pUC18-T载体 | Sangon Biotech | B300692 |
| ChIP-qPCR | Pierce磁性ChIP试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 26157 |
| 兔抗UHRF1抗体 | Novus Biologicals | NBP2-20807 | |
| 兔IgG | Thermo Fisher Scientific | 26157 | |
| 代谢组学分析 | Bruker Advance III 600波谱仪 | Bruker BioSpin | -- |
| 乳酸检测 | 乳酸比色试剂盒 | Elabscience | E-BC-K044-M |
| ECAR检测 | Seahorse XFe24通量分析仪 | Agilent | -- |
| SpectraMax iD5多功能酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| 糖酵解速率测定试剂盒 | Agilent | 103020–100 | |
| 细胞外酸化检测试剂盒 | Bestbio | BB-48311 | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | Solarbio | T8200 |
| 牛血清白蛋白 | Shanghai Epizyme Biomedical Technology Co., China | PS113 | |
| SFRP5一抗 | ABclonal Biotechnology | A19133 | |
| 抗兔IgG Alexa Fluor®-594二抗 | Servicebio | GB28301 | |
| DAPI | Servicebio | -- | |
| BLI测定 | ForteBio Octet RED 96e系统 | ForteBio | -- |
| 小分子抑制剂筛选 | Schrödinger Maestro软件 | Schrödinger | -- |
| MCE生物活性化合物库 | MedChemExpress | -- | |
| 药物处理 | UM164 | Selleck Chemicals | S8706 |
| SB203580 | MedChemExpress | HY-10256 | |
| BOX5 | Selleck Chemicals | P1216 | |
| MST | Monolith RED-NHS试剂盒 | NanoTemper | -- |
| Monolith NT.115标准包被毛细管 | NanoTemper | -- | |
| 体内动物实验 | 活体成像系统 | PerkinElmer | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本分析 | 样本类型、疾病状态（RR/ND/CR/HD）、样本量、UHRF1表达检测方法（RT-qPCR、Western blot）、生存分析分组阈值 阅读提示：Methods: Patients and healthy donors sample isolation; Survival analysis; Results: ScRNA-seq reveals the involvement of UHRF1 |
| 细胞系与培养条件 | 细胞系名称（Nalm6, Reh等）、培养基（RPMI 1640等）、FBS浓度、培养温度、CO2浓度、湿度、细胞状态（对数生长期） 阅读提示：Methods: Cell lines |
| UHRF1敲除与回补实验 | sgRNA序列、转染试剂、敲除载体（LentiCRISPR v2）、回补载体、筛选药物（puromycin）及时间、细胞系 阅读提示：Methods: Plasmid construction and transfection in B-ALL cell lines; Results: UHRF1 affects cell proliferation |
| 基因表达分析 | RNA提取方法、逆转录试剂、qPCR试剂、内参基因（18S）、引物序列、循环条件 阅读提示：Methods: RNA extraction and real-time quantitative reverse transcription PCR |
| 蛋白质表达分析 | 裂解缓冲液、蛋白定量方法、一抗二抗信息（品牌、货号）、检测系统 阅读提示：Methods: Western blotting |
| 细胞功能实验 | 细胞增殖检测方法（MTS或MTT）、检测时间点、细胞数量、凋亡染色（Annexin-V/7-AAD）、细胞周期染色（PI）、流式细胞仪设置 阅读提示：Methods: Apoptosis, cell proliferation, and cell cycle assays |
| DNA甲基化分析 | DNA提取试剂盒、亚硫酸盐转化试剂盒、850K芯片操作流程、BSP引物、甲基化分析方法（BMIQ等）、显著性阈值 阅读提示：Methods: 850K Methylation BeadChip array; BSP |
| ChIP实验 | 交联条件、超声破碎参数、抗体信息、qPCR引物、结果计算方式（% input） 阅读提示：Methods: CHIP-qPCR |
| 糖酵解功能分析 | ECAR测定方法（Seahorse或荧光探针）、细胞数量、仪器设置、乳酸检测试剂盒、代谢组学样本准备 阅读提示：Methods: Measurement of extracellular acidification rate (ECAR); Metabolomics analysis |
| 分子互作验证 | BLI测定条件（蛋白浓度、稀释系列、结合/解离时间）、MST测定条件（荧光标记、浓度梯度） 阅读提示：Methods: Biolayer interferometry (BLI) assay; Microscale thermophoresis (MST) |
| 小分子抑制剂筛选与验证 | 虚拟筛选流程（软件、化合物库、PDB结构）、UM164浓度范围、处理时间、检测指标 阅读提示：Methods: Screening of small molecule inhibitors of UHRF1; Results: UM164 inhibits the survival of B-ALL cells |
| 体内实验 | 小鼠品系、周龄、性别、细胞系和数量、移植途径、药物剂量和给药方案、评估时间点、检测指标 阅读提示：Methods: Cell line-derived xenograft (CDX) transplantation model and treatment; Results: UM164 delays the progression |
| 统计分析 | 统计软件、数据表示方式（mean±SD）、分析组间差异的方法、生存分析方法、显著性水平 阅读提示：Methods: Statistics |