验证TIP60在HCC中的高表达及功能
确认TIP60在HCC组织和细胞中的表达水平，并评估其对免疫逃逸和恶性表型的影响。
通过Western blotting检测HCC组织及细胞中TIP60表达；在Hep3B和MHCC97H细胞中敲低TIP60，建立PBMCs共培养体系，检测CD8+ T细胞比例和IFN-γ水平，并进行CCK-8、集落形成和Transwell实验。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
TIP60介导的KIAA1429乙酰化通过N6-甲基腺苷-KDM5B介导的FoxO1调控促进肝细胞癌的转移和免疫逃逸
Acetylated KIAA1429 by TIP60 facilitates metastasis and immune evasion of hepatocellular carcinoma via N6-methyladenosine-KDM5B-mediated regulation of FoxO1.
实验完整度
高包含体外细胞功能实验（CCK-8、Transwell）、机制验证（Co-IP、m6A分析、ChIP）及体内NOD/SCID小鼠模型实验。
主要模型
Hep3B细胞 MHCC97H细胞 NOD/SCID小鼠移植瘤模型
重点核对
HCC细胞系（Hep3B、MHCC97H）及正常THLE-3细胞 shRNA转染敲低TIP60、KIAA1429、KDM5B、FoxO1 PBMCs共培养模型及PD-L1抗体处理 NOD/SCID小鼠皮下接种2×10^6 HCC细胞，肿瘤体积>100mm³后尾静脉注射免疫细胞混合物
摘要
肝细胞癌（HCC）以程序性细胞死亡配体1（PD-L1）介导的免疫逃逸为特征。本研究旨在阐明N6-甲基腺苷（m6A）复合物组分KIAA1429在肝细胞癌免疫逃逸中的功能及机制。通过免疫荧光染色评估PD-L1表达，流式细胞术测定CD8+ T细胞百分比，酶联免疫吸附试验检测IFN-γ水平，CCK-8、集落形成和Transwell实验分别评估细胞增殖、迁移和侵袭，RNA甲基化定量实验、m6A斑点印迹和甲基化RNA免疫沉淀-qPCR测定m6A修饰水平，RNA pull-down、RNA免疫沉淀、染色质免疫沉淀和免疫共沉淀验证分子相互作用，并在NOD/SCID小鼠中评估体内HCC生长。我们发现TIP60、KIAA1429和KDM5B在HCC细胞中高表达，而FoxO1低表达。功能上，TIP60/KIAA1429沉默抑制了PD-L1介导的HCC免疫逃逸、生长、迁移和侵袭。机制上，TIP60导致KIAA1429乙酰化，以m6A-YTHDF1依赖的方式促进KDM5B表达，进而抑制FoxO1的转录和表达。强制表达YTHDF1或敲低FoxO1可显著逆转shKIAA1429对HCC免疫逃逸、生长、迁移和侵袭的抑制作用。总之，这些发现表明乙酰化的KIAA1429介导的m6A修饰通过调控KDM5B/FoxO1轴赋予HCC细胞免疫逃逸能力，为靶向KIAA1429治疗HCC提供了治疗选择。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探讨KIAA1429在肝细胞癌免疫逃逸中的功能及上游调控机制。
- 核心机制
- TIP60乙酰化KIAA1429（K156位点），通过m6A-YTHDF1依赖方式稳定KDM5B mRNA，增强KDM5B表达，后者结合FoxO1启动子区域（-153/-129）抑制其转录，导致PD-L1上调并促进免疫逃逸。
- 主要证据
- 通过Co-IP验证TIP60与KIAA1429互作及K156乙酰化位点；MeRIP-qPCR和RNA pulldown证明KIAA1429/YTHDF1调控KDM5B m6A修饰；ChIP证实KDM5B结合FoxO1启动子；功能实验显示敲低KIAA1429抑制PD-L1表达，增强CD8+ T细胞比例和IFN-γ释放，并抑制体内肿瘤生长。
- 研究意义
- 首次揭示KIAA1429通过TIP60乙酰化及m6A机制促进HCC免疫逃逸，提出靶向KIAA1429或TIP60/KIAA1429/KDM5B轴可能成为治疗HCC的潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证TIP60介导KIAA1429乙酰化
探究TIP60是否通过乙酰化修饰KIAA1429，并确定乙酰化位点。
通过Co-IP验证外源性和内源性TIP60与KIAA1429相互作用；在敲低TIP60细胞中检测KIAA1429乙酰化水平；转染KIAA1429突变体（K156R、K1587R）确定乙酰化位点，并检测PD-L1表达变化。
验证KIAA1429对HCC免疫逃逸和恶性表型的影响
评估敲低KIAA1429对HCC细胞PD-L1表达、T细胞活化和体外恶性行为的作用。
在HCC细胞中敲低KIAA1429，Western blotting和免疫荧光检测PD-L1表达；PBMCs共培养检测CD8+ T细胞和IFN-γ；CCK-8、集落形成和Transwell分析增殖、迁移和侵袭。
体内验证KIAA1429敲低对肿瘤生长的影响
在NOD/SCID小鼠移植瘤模型中验证KIAA1429敲低对HCC生长和免疫逃逸的影响。
皮下注射敲低KIAA1429的HCC细胞，待肿瘤体积>100mm³后，尾静脉注射PBMCs和活化T淋巴细胞，监测肿瘤生长，并通过免疫组化检测Ki-67、CD8和Granzyme B表达。
验证KIAA1429介导的m6A修饰调控KDM5B表达
探究KIAA1429是否通过m6A修饰稳定KDM5B mRNA，并识别其m6A阅读蛋白。
通过数据库预测和RNA pulldown筛选结合KDM5B的m6A writer和reader；在敲低KIAA1429细胞中检测m6A水平和KDM5B m6A富集；放线菌素D实验评估mRNA稳定性；RT-qPCR和Western blotting验证YTHDF1对KDM5B表达的调控。
验证KDM5B对FoxO1的转录调控
确定KDM5B是否通过结合FoxO1启动子抑制其转录，并验证该轴在KIAA1429功能中的重要性。
Western blotting检测KDM5B敲低后FoxO1表达；AnimalTFDB4.0预测结合位点；ChIP验证KDM5B和H3K4me3与FoxO1启动子的结合；功能实验验证FoxO1参与KIAA1429介导的表型。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | MEM培养基 | Gibco | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher | -- |
| 基因表达分析 | TRIzol试剂 | Sigma-Aldrich | -- |
| 第一链cDNA合成试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- | |
| SYBR Green定量RT-qPCR试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 蛋白质提取与定量 | RIPA裂解缓冲液 | Elabscience | -- |
| BCA蛋白定量比色试剂盒 | Elabscience | -- | |
| 流式分析 | 抗CD8 FITC抗体 | eBiosciences | MHCD0801-4 |
| 免疫检测 | 人IFN-γ ELISA试剂盒 | Abcam | -- |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂 | Yeasen | -- |
| 迁移和侵袭检测 | Matrigel基质胶 | Sigma-Aldrich | -- |
| 免疫共沉淀 | IP裂解缓冲液 | Beyotime | -- |
| 抗KIAA1429抗体 | Proteintech | 25712-1-AP | |
| 抗TIP60抗体 | Abcam | ab300521 | |
| 抗乙酰化赖氨酸抗体 | Abcam | ab190479 | |
| 抗IgG抗体 | Abcam | ab172730 | |
| RNA m6A定量 | EpiQuik m6A RNA甲基化定量试剂盒 | Epigentek | -- |
| Magna MeRIP m6A试剂盒 | Millipore | -- | |
| RNA m6A检测 | Hybond-N+膜 | GE Healthcare | -- |
| RNA pull-down | Pierce磁珠RNA-蛋白Pull-Down试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| RNA免疫沉淀 | Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Millipore | -- |
| 抗YTHDF1抗体 | Abcam | ab220162 | |
| 染色质免疫沉淀 | Magna ChIP A/G试剂盒 | Millipore | -- |
| 抗KDM5B抗体 | Cell Signaling Technology | 15327 | |
| 抗H3K4me3抗体 | Cell Signaling Technology | 9751 | |
| GST pull-down | 谷胱甘肽琼脂糖 | Yeasen | -- |
| 免疫组织化学 | 抗Ki-67抗体 | Abcam | ab15580 |
| 抗CD8抗体 | Abcam | ab316778 | |
| 抗颗粒酶B抗体 | Abcam | ab255598 | |
| 荧光显微镜观察 | 荧光显微镜 | Leica | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | HCC细胞系（Hep3B、MHCC97H）在含10% FBS的DMEM培养基中培养，HEK293T细胞在DMEM中培养，细胞在37°C、5% CO2条件下维持。 阅读提示：Materials and methods: Cell culture |
| 细胞转染 | shRNA和过表达质粒（shTIP60, shKIAA1429, shKDM5B, shFoxO1, YTHDF1等）使用Lipofectamine 2000转染，转染后48小时进行检测。 阅读提示：Materials and methods: Cell transfection |
| PBMCs共培养 | PBMCs从HCC患者分离，用PHA和rhIL-2刺激激活后与HCC细胞共培养48小时，有时加入PD-L1阻断抗体。 阅读提示：Materials and methods: Isolation of peripheral blood mononuclear cells and coculture with HCC cells |
| 动物模型 | NOD/SCID小鼠皮下注射2×10^6个感染腺病毒的HCC细胞，当肿瘤体积>100mm³时，每周一次尾静脉注射PBMCs（5×10^6）和活化T淋巴细胞（1×10^7），共三次，监测4周。 阅读提示：Materials and methods: Animal models |
| 机制验证 | Co-IP、RNA pull-down、RIP、ChIP实验需按试剂盒说明书操作，注意抗体稀释度和孵育时间。 阅读提示：Materials and methods: Co-immunoprecipitation, RNA pulldown assay, RNA immunoprecipitation assay, Chromatin immunoprecipitation assay |