建立体外免疫损伤模型
模拟心肌免疫细胞浸润，观察激活免疫细胞对心肌细胞的影响
将hiPSC-CMs与aPBMCs共培养，检测心肌细胞活力（阻抗）、电活动（EFP）、LDH释放及形态变化。
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MLKL介导的坏死性凋亡对免疫相关心肌损伤起主要作用
MLKL-Mediated Necroptosis Predominantly Contributes to Immune-Associated Myocardial Damage.
实验完整度
高包含体外共培养模型、转录组分析、药理学抑制、siRNA敲低及体内小鼠模型验证，功能验证和机制验证齐全。
主要模型
人诱导多能干细胞来源心肌细胞（hiPSC-CMs） 激活的人外周血单核细胞（aPBMCs）共培养模型 免疫检查点抑制剂（ICIs）诱导的心肌炎小鼠模型
重点核对
aPBMCs与hiPSC-CMs的效应-靶比（E:T）为5:1，共培养48小时 坏死性凋亡抑制剂NSA、Nec-1、GSK872均使用10 μM，预处理6小时 MLKL siRNA敲低效率及保护效果在转染后48小时评估 小鼠模型：抗PD-1和抗CTLA-4抗体各300 μg/只，每3天一次，共10次 MLKL抑制剂GW806742X剂量为0.3 mg/kg，每2天腹腔注射
摘要
激活的T细胞和巨噬细胞在免疫相关心肌炎中发挥关键作用。然而，免疫细胞驱动心肌细胞损伤的分子和细胞机制仍知之甚少。在本研究中，我们将人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）与激活的人外周血单核细胞（aPBMCs）共培养，以模拟心肌免疫细胞浸润。结果表明，aPBMCs以剂量和时间依赖的方式诱导hiPSC-CMs死亡。转录组分析揭示了多种死亡通路的激活，包括焦亡、凋亡和坏死性凋亡。不同死亡通路关键蛋白免疫荧光染色的时间过程表明，坏死性凋亡是最早激活的通路。通过靶向混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）、受体相互作用蛋白激酶1（RIPK1）和受体相互作用蛋白激酶3（RIPK3）来药理学阻断坏死性凋亡，可保护hiPSC-CMs免受aPBMCs诱导的损伤，而焦亡和凋亡抑制剂则无保护作用。此外，hiPSC-CMs中MLKL敲低可防止aPBMCs攻击引起的细胞死亡。另外，我们使用抗程序性细胞死亡1（PD-1）和抗细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA-4）抗体的长期联合治疗，在免疫检查点抑制剂（ICIs）相关心肌炎小鼠模型中验证了阻断坏死性凋亡的心脏保护作用。ICIs导致血清中心肌损伤标志物升高和激活的免疫细胞浸润。此外，体内给予MLKL抑制剂可预防ICIs诱导的心肌损伤。总之，我们的研究结果表明，MLKL介导的坏死性凋亡主要导致激活的免疫细胞引起的心肌细胞死亡。抑制坏死性凋亡可能是治疗心肌炎心肌损伤的有效方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 免疫细胞驱动心肌细胞损伤的分子和细胞机制是什么，以及哪种细胞死亡通路起主导作用？
- 核心机制
- MLKL介导的坏死性凋亡是免疫激活诱导心肌细胞死亡的主要通路，坏死性凋亡先于焦亡和凋亡激活，抑制MLKL可保护心肌。
- 主要证据
- 体外共培养模型中，aPBMCs诱导hiPSC-CMs死亡，转录组分析显示坏死性凋亡通路激活，MLKL在6小时即上调；药理学抑制MLKL、RIPK1、RIPK3及siRNA敲低MLKL均保护心肌细胞。体内ICIs小鼠模型中，MLKL抑制剂GW80减轻心肌损伤。
- 研究意义
- 研究揭示了免疫相关心肌损伤的机制，提出抑制坏死性凋亡可能成为治疗心肌炎的有效策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组分析死亡通路
鉴定激活免疫细胞诱导心肌细胞死亡的潜在通路
对共培养6小时的GFP-CMs进行RNA测序，分析差异表达基因及通路富集。
动态检测死亡通路蛋白表达
确定不同死亡通路激活的时间顺序
通过免疫荧光检测焦亡、凋亡、坏死性凋亡关键蛋白的表达。
药理学抑制不同死亡通路
确定哪个死亡通路是心肌细胞死亡的主要驱动力
分别用焦亡、凋亡、坏死性凋亡抑制剂预处理心肌细胞，观察对aPBMCs诱导损伤的保护作用。
MLKL敲低验证
进一步确认MLKL在心肌细胞损伤中的作用
用siRNA敲低MLKL表达，观察对aPBMCs诱导损伤的保护作用。
小鼠ICIs心肌炎模型验证
验证坏死性凋亡抑制在体内的保护作用
用抗PD-1和抗CTLA-4抗体诱导小鼠心肌炎，给予MLKL抑制剂GW80，评估心肌损伤。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Excell | -- | |
| 心肌细胞维持培养基 | Cellapy | -- | |
| PGM1培养基 | Cellapy | -- | |
| Matrigel基质胶 | Corning | -- | |
| 0.25%胰蛋白酶-EDTA | -- | -- | |
| PBMC激活 | 抗CD3单克隆抗体 | Tonglihaiyuan | -- |
| 抗CD28单克隆抗体 | Tonglihaiyuan | -- | |
| 细胞培养 | CardioEasy心肌细胞分化试剂盒 | Cellapy | -- |
| 细胞活力检测 | CardioExcyte96传感器板 | Nanion | -- |
| LDH-Glo细胞毒性检测试剂盒 | Promega | -- | |
| 流式细胞术 | 7-AAD | -- | -- |
| 药物处理 | Necrostatin-1 | MedChemExpress | -- |
| GSK872 | MedChemExpress | -- | |
| 坏死磺酰胺 | MedChemExpress | -- | |
| Emricasan | MedChemExpress | -- | |
| MCC950 | MedChemExpress | -- | |
| Ferrostatin-1 | MedChemExpress | -- | |
| Z-VAD-FMK | MedChemExpress | -- | |
| 转染 | CALNP RNAi体外转染试剂 | D-Nano Therapeutics | -- |
| RNA提取与逆转录 | RNA提取试剂盒 | Promega | -- |
| 逆转录试剂盒 | Promega | -- | |
| qPCR | GoTaq qPCR预混液试剂盒 | Promega | -- |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Multi science | -- | |
| 4%-20%预制SDS-PAGE凝胶 | ACE | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | 抗cTnT抗体 | Affinity | #DF6261 |
| 抗α-actinin抗体 | Sigma | A7811 | |
| 抗NLRP3抗体 | Huabio | ET1610-93 | |
| 抗GSDMD抗体 | Huabio | HA721144 | |
| 抗MLKL抗体 | Proteintech | 66675-1-Ig | |
| 抗cleaved caspase-3抗体 | Immunoway | YM3431 | |
| Hoechst染料 | Solarbio | -- | |
| CoraLite 594标记山羊抗小鼠IgG | Proteintech | -- | |
| CoraLite 594标记山羊抗兔IgG | Proteintech | -- | |
| Western blot | 抗PD-L1抗体 | Proteintech | 66248-1-Ig |
| 抗IL-6抗体 | Abclonal | A0286 | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| 抗p-MLKL抗体 | MedChemExpress | HY-P81878 | |
| 动物实验 | 抗PD-1单克隆抗体（克隆RMP1-14） | Bio X Cell | BE0146 |
| 抗CTLA-4单克隆抗体（克隆9H10） | Bio X Cell | BE0131 | |
| 大鼠IgG2a同型对照（克隆2A3） | Bio X Cell | BE0089 | |
| GW806742X | MedChemExpress | -- | |
| ELISA | 用于cTnI、CKMB、CXCL9、CXCL10的ELISA试剂盒 | Elabscience | -- |
| 组织学 | 抗CD4抗体 | Abcam | ab288724 |
| 抗CD8抗体 | Cell Signaling Technology | #98941 | |
| 抗CD44抗体 | Cell Signaling Technology | #37259 | |
| 抗GSDMD抗体 | Abcam | ab219800 | |
| 抗NLRP3抗体 | Abways | CY5651 | |
| 抗cleaved caspase-3抗体 | Affinity | AF7022 | |
| 抗MLKL抗体 | Proteintech | 66675-1-Ig | |
| 活细胞成像 | IncuCyte活细胞成像仪 | Sartorius | -- |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss LSM710共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| 组织切片扫描 | 全景显微镜扫描仪 | DHISTECH Ltd. | -- |
| 电生理记录 | CardioExcyte96系统 | Nanion | -- |
| 心电图记录 | Biopac150系统 | Biopac Systems | -- |
| RNA测序 | Illumina Novaseq测序平台 | Illumina | -- |
| Bioanalyzer 2100系统 | -- | -- | |
| 蛋白质印迹成像 | Li-Cor Odyssey成像系统 | Li-Cor | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PBMC分离与激活 | PBMC来源健康供体，激活使用抗CD3/CD28抗体各0.5 μg/ml，处理时间24小时 阅读提示：Materials and Methods: Isolation and Activation of Human Immune Cells |
| hiPSC-CMs培养 | hiPSC-CMs来源及代数，种子密度40,000个/孔，培养基及更换频率 阅读提示：Materials and Methods: Electrophysiology Activity and Viability Recording using the CardioExcyte96 System |
| 共培养实验 | E:T比（5:1）、共培养时间（48小时）、培养基（RPMI 1640含10% FBS） 阅读提示：Materials and Methods: Co-culturing hiPSC-CMs with Activated Immune Cells; Results: Activated Immune Cells Caused Severe and Irreversible Damage to Human Cardiomyocytes |
| 抑制剂处理 | 抑制剂浓度（10 μM）、预处理时间（6小时）、溶剂对照 阅读提示：Materials and Methods: Co-culturing hiPSC-CMs with Activated Immune Cells; Figure 3 legend |
| MLKL敲低 | siRNA转染试剂、转染时间、敲低效率评估时间（48小时） 阅读提示：Materials and Methods: siRNA Transfection; Results: MLKL Knockdown Alleviated Activated Immune Cells Induced Cardiomyocyte Death |
| 小鼠模型 | 小鼠品系、性别、年龄，ICIs抗体剂量、给药频率及时长，MLKL抑制剂剂量及给药方案，对照组设置 阅读提示：Materials and Methods: Animal Studies; Results: ICIs Induced Myocardial Immune Injury and Blockade of MLKL in vivo Prevented ICIs-induced Myocardial Damage |
| 心肌损伤检测 | 血清心肌损伤标志物检测方法，组织病理学染色流程，免疫组化抗体及稀释度 阅读提示：Materials and Methods: Enzyme-linked Immunosorbent Assay, Histology and Immunohistochemical Staining |