建立DOR动物模型
建立DOR大鼠和小鼠模型，以模拟人类卵巢储备功能减退的病理状态。
通过灌胃TGs（90 mg/kg）4周建立大鼠DOR模型；通过皮内注射pZP3-CFA混合液和两次pZP3-FICA混合液建立小鼠DOR模型。并通过检测血清AMH水平确认模型建立成功。
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滋肾育胎丸通过介导PI3K-Akt通路和卵巢凋亡水平改善卵巢储备功能
Zishen Yutai pill ameliorates ovarian reserve by mediating PI3K-Akt pathway and apoptosis level in ovary.
实验完整度
高体外模型、动物模型、患者样本等至少两个独立证据层级（此处为两个动物模型），并包含功能验证（ELISA）和机制验证（mRNA测序、qRT-PCR）
主要模型
TGs诱导的DOR大鼠模型 pZP3诱导的DOR小鼠模型
重点核对
TGs诱导DOR大鼠模型：90 mg/kg剂量灌胃，持续4周 pZP3诱导DOR小鼠模型：200 μl pZP3-CFA(1:1)混合物皮内注射，后两次注射pZP3-FICA(1:1)间隔2周 ZYP干预剂量：大鼠低、中、高剂量分别为0.68、1.35、2.70 g/kg/天，小鼠分别为0.98、1.95、3.9 g/kg/天 干预持续时间为4周 DHEA阳性对照组剂量：0.02 g/kg/天
摘要
滋肾育胎丸（ZYP）是中国广泛用于临床治疗卵巢储备功能减退（DOR）所致不孕症的中成药。然而，ZYP治疗DOR的药理作用及其潜在机制仍知之甚少。本研究旨在评估ZYP对DOR的治疗效果并阐明其潜在机制。选择雷公藤多苷（TGs）诱导的DOR大鼠模型和pZP3诱导的DOR小鼠模型来评估ZYP治疗DOR的有效性。两种模型的干预均持续4周。ZYP给药显著增加了DOR大鼠和小鼠模型中的原始卵泡数量及血清AMH水平。此外，ZYP调节了DOR大鼠卵巢中的凋亡通路和凋亡相关分子，包括PI3K-Akt信号通路、Bcl6和Abtb2。ZYP组中卵巢凋亡水平呈剂量依赖性显著下调。因此，我们证明了ZYP改善了DOR模型中的卵巢储备功能。ZYP对DOR的机制可能是通过调节PI3K-Akt信号通路和凋亡分子（Bcl6、Abtb2）降低卵巢凋亡水平来实现的。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Zishen Yutai Pill对DOR的治疗效果及其潜在机制是什么？
- 核心机制
- ZYP通过调节PI3K-Akt信号通路，下调凋亡相关分子Bcl6和Abtb2的表达，降低卵巢凋亡水平，从而改善卵巢储备功能。
- 主要证据
- 在TGs诱导的DOR大鼠和pZP3诱导的DOR小鼠模型中，ZYP治疗4周显著增加了原始卵泡数量和血清AMH水平；mRNA测序和qRT-PCR分析显示ZYP调节PI3K-Akt通路及Bcl6、Abtb2表达，Cell Death Detection ELISA证实了凋亡水平的剂量依赖性下调。
- 研究意义
- 本研究为ZYP治疗DOR提供了证据，并提示其机制与PI3K-Akt通路和凋亡调控有关，有望为临床DOR治疗提供新的选择。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ZYP干预治疗
评估不同剂量的ZYP对DOR模型卵巢储备功能的影响。
将模型动物随机分为模型组、ZYP低、中、高剂量组和DHEA阳性对照组，分别给予相应药物或溶剂（0.5% CMC-Na），每日一次，持续4周。
评估卵巢形态和功能
检测ZYP对卵巢组织形态、卵泡数量、激素水平和动情周期的影响。
通过HE染色观察卵巢组织学变化并计数不同阶段卵泡和黄体；通过ELISA检测血清AMH、E2、FSH、LH水平；通过阴道涂片监测动情周期。
转录组测序及分析
识别ZYP处理后的差异表达基因及潜在信号通路，探索分子机制。
对大鼠卵巢组织进行mRNA测序，筛选DEGs，并进行KEGG通路富集分析；随后用qRT-PCR验证关键基因的表达。
凋亡水平检测
验证ZYP对卵巢凋亡水平的影响。
使用Cell Death Detection ELISA试剂盒检测卵巢组织裂解液中的DNA片段化，反映凋亡水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估卵巢形态和功能
验证凋亡水平
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 滋肾育胎丸 | Guangzhou Baiyunshan Zhongyi Pharmaceutical Company Limited | -- |
| 脱氢表雄酮 | Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd | -- | |
| 模型诱导 | 雷公藤多苷片 | Yuanda Pharmaceutical Huangshi Feiyun Pharmaceutical Co., Ltd | -- |
| 透明带蛋白3肽 | ChinaPeptides | -- | |
| 完全弗氏佐剂 | Sigma | -- | |
| 不完全弗氏佐剂 | -- | -- | |
| 激素检测 | AMH、FSH、LH、E2 ELISA试剂盒 | Elabscience | -- |
| 凋亡检测 | 细胞死亡检测ELISA试剂盒 | Roche | 11,544,675,001 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Ambion | -- |
| Quick-RNA MicroPrep试剂盒 | ZYMO research | -- | |
| RNA测序文库构建 | SureSelect链特异性RNA组分试剂盒 | Agilent | -- |
| 高灵敏度DNA试剂盒 | Agilent | -- | |
| RNA浓度测定 | Qubit双链DNA高灵敏度检测试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| qRT-PCR | 实时荧光定量PCR系统 | DaAn Gene | DA7600 |
| PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser | Takara Bio | -- | |
| 荧光定量检测试剂盒 | Talent | -- | |
| qRT-PCR引物 | GAPDH、Hsp90aa1、Pik3r5、Nr4a1、Rxra、Gnb3、Tcl1a、Bcl6、Abtb2引物 | Dingguo | -- |
| RNA测序 | Illumina NovaSeq 6000 | -- | -- |
| 组织切片观察 | 光学显微镜(DP73) | OLYMPUS | -- |
| 数字切片扫描系统(PRECICE 600) | UNIC TECHNOLOGIES | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 大鼠模型：TGs剂量90 mg/kg灌胃每日一次，持续4周；小鼠模型：pZP3剂量200 μl与CFA(1:1)皮内注射，2周后与FICA(1:1)注射，再2周后重复一次。 阅读提示：Materials and methods: Establishment of the DOR rat model, Establishment of the DOR mouse model |
| 药物干预 | ZYP剂量：大鼠0.68、1.35、2.70 g/kg/天；小鼠0.98、1.95、3.9 g/kg/天；DHEA剂量0.02 g/kg/天；给药方式：灌胃；干预时间：4周。 阅读提示：Materials and methods: Establishment of the DOR rat model, Establishment of the DOR mouse model |
| 卵巢形态学评估 | 卵巢组织固定于4% PFA，石蜡包埋，切片厚度4 μm，HE染色，卵泡分类标准（原始、初级、次级、窦状）和计数。 阅读提示：Materials and methods: Histological observation of morphology, and follicle classification |
| 血清激素检测 | ELISA试剂盒（Elabscience）检测AMH、E2、FSH、LH，操作步骤按说明书。 阅读提示：Materials and methods: Serum hormone detection by ELISA |
| mRNA测序 | 卵巢组织（对照、模型、ZYP-H组各n=5）提取RNA，文库构建，Illumina NovaSeq 6000测序，DEGs筛选标准（|log2 fold change|≥1.5，P<0.05）及KEGG分析。 阅读提示：Materials and methods: Messenger RNA sequencing |
| qRT-PCR验证 | 引物序列（Table 4），使用PrimeScript™ RT reagent Kit，反应条件（95°C 3min，40循环95°C 5s，60°C 15s），相对定量用2^-ΔΔCT，内参GAPDH。 阅读提示：Materials and methods: Real-time polymerase chain reaction, Table 4 |
| 凋亡检测 | 使用Roche Cell Death Detection ELISA Kit（cat# 11,544,675,001），按说明书操作，卵巢组织匀浆离心取上清。 阅读提示：Materials and methods: Apoptosis detection by ELISA |
| 统计分析 | SPSS 18.0，连续变量用均值±SD，两组比较用Student's t检验，多组比较用单因素方差分析，分类数据用卡方或Fisher精确检验。 阅读提示：Materials and methods: Statistical analysis |