结构基础虚拟筛选和药理验证
筛选并验证GI-Y2作为新型GSDMD抑制剂。
使用GSDMD孔晶体结构进行虚拟筛选，并通过细胞焦亡模型和脓毒症模型进行药理验证。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
新型GSDMD抑制剂GI-Y2通过抗焦亡作用减轻动脉粥样硬化
The novel GSDMD inhibitor GI-Y2 exerts antipyroptotic effects to reduce atherosclerosis.
实验完整度
高包含分子对接、SPR、DARTS、pull-down等体外结合实验，细胞水平焦亡模型，以及ApoE-/-和Gsdmd-/-ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型，并进行功能验证和机制研究。
主要模型
PMA分化的THP-1细胞 小鼠原代腹膜巨噬细胞（MPMs） ApoE-/-小鼠高脂饮食诱导的动脉粥样硬化模型 Gsdmd-/-ApoE-/-小鼠高脂饮食诱导的动脉粥样硬化模型
重点核对
GI-Y2浓度（10或20 µM）和预处理时间（1小时）在细胞实验中 LPS和nigericin浓度及处理时间（1 µg/ml, 4小时；10 µM, 30分钟） ox-LDL浓度（50 µg/mL）和处理时间（24小时） ApoE-/-小鼠高脂饮食喂养时间（12周）和GI-Y2给药方案（10或20 mg/kg/2天，灌胃） 巨噬细胞膜包被GI-Y2纳米颗粒的给药方案（0.03 mg/kg/3天，静脉注射）
摘要
我们确认GI-Y2是GSDMD的新型抑制剂。GI-Y2直接与GSDMD的Arg10残基相互作用，并减少GSDMD-N的膜结合。我们构建了巨噬细胞膜包被的GI-Y2纳米颗粒，以增强GI-Y2对动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的靶向性，并在体内证明了其血管保护作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 开发新的GSDMD抑制剂，并阐明其在动脉粥样硬化中的抑制作用机制。
- 核心机制
- GI-Y2直接与GSDMD的Arg10残基结合，减少GSDMD-N的膜结合，从而抑制焦亡。
- 主要证据
- 通过SPR、DARTS和pull-down实验证实GI-Y2与GSDMD直接结合；在ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型中，GI-Y2剂量依赖性减少动脉粥样硬化斑块，并减少焦亡和巨噬细胞浸润；在Gsdmd-/-ApoE-/-小鼠中，GI-Y2的效应消失，表明其靶向GSDMD。
- 研究意义
- GI-Y2是靶向GSDMD的潜在治疗心血管疾病的药物，为GSDMD介导的焦亡研究提供了新化合物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
GI-Y2与GSDMD结合机制研究
确定GI-Y2与GSDMD的直接结合位点。
通过SPR、DARTS、pull-down实验以及分子对接和分子动力学模拟，确定GI-Y2与GSDMD的相互作用及关键残基。
体内抗动脉粥样硬化效果评估
评估GI-Y2对高脂饮食诱导的动脉粥样硬化的治疗作用。
ApoE-/-小鼠高脂饮食6周后，给予GI-Y2（10或20 mg/kg/2天，灌胃）6周，检测主动脉斑块面积、脂质沉积和胶原沉积。
靶点验证
验证GI-Y2的抗动脉粥样硬化作用是否依赖于GSDMD。
在Gsdmd-/-ApoE-/-小鼠中重复上述实验，比较GI-Y2的效果。
巨噬细胞焦亡和浸润分析
检测GI-Y2对动脉粥样硬化中主动脉焦亡和巨噬细胞浸润的影响。
检测血清和主动脉组织中IL-1β、IL-18水平，以及F4/80、Ly6G、Ly6C阳性细胞浸润，并通过免疫荧光检测GSDMD表达。
体外巨噬细胞焦亡模型验证
验证GI-Y2对ox-LDL诱导的巨噬细胞焦亡的抑制作用。
使用小鼠原代腹膜巨噬细胞（MPMs），预处理GI-Y2（10或20 µM, 1小时）后，用ox-LDL（50 µg/mL, 24小时）刺激，检测IL-1β释放、GSDMD-N表达和膜结合。
巨噬细胞膜包被纳米颗粒的构建与评估
提高GI-Y2对斑块内巨噬细胞的靶向性，并评估其治疗效果。
构建巨噬细胞膜包被的GI-Y2纳米颗粒（GI-Y2@MM-NPs），在ApoE-/-小鼠中评估其靶向性和治疗效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证GI-Y2与GSDMD的直接结合
结构预测与模拟
检测分子表达变化
评估体内动脉粥样硬化效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 结构虚拟筛选 | Schrödinger Maestro | Schrödinger, LLC | -- |
| 分子对接 | AutoDockFR 1.0 | AutoDockFR | -- |
| 蛋白结合实验 | 链霉蛋白酶 | Sigma-Aldrich | 10165921001 |
| 细胞培养 | PMA | MedChemExpress | HY-18739 |
| 氧化低密度脂蛋白 | Yiyuan Biotechnology | YB-002 | |
| 脂多糖 | Sigma Aldrich | -- | |
| 尼日利亚霉素 | MedChemExpress | HY-100381 | |
| 人M-CSF重组蛋白 | PeproTech | 300-25-2UG | |
| 分子克隆 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher | -- |
| 纳米颗粒制备 | 聚乳酸-羟基乙酸共聚物 | QIYUE Biology | -- |
| 磁力搅拌器 | IKA | -- | |
| 冻干机 | Christ | -- | |
| 纳米颗粒表征 | NanoPhotometer N50紫外分光光度计 | Implen | -- |
| Zetasizer Nano ZS激光粒度分析仪 | Malvern | -- | |
| 组织切片 | OCT包埋剂 | Sakura | -- |
| 免疫组化 | Masson三色染色剂 | Solarbio | -- |
| 免疫荧光 | GSDMD抗体 | Abcam | ab219800 |
| F4/80抗体 | Santa Cruz | sc-26642 | |
| Alexa-488/647二抗 | Abcam | -- | |
| DAPI染色液 | -- | -- | |
| 免疫组化 | Ly6C抗体 | Abcam | HA500088 |
| Ly6G抗体 | Abcam | 0809-11 | |
| 血清生化分析 | 贝克曼AU480生化分析仪 | Beckman | -- |
| 细胞毒性检测 | LDH检测试剂盒 | Solarbio | BC0685 |
| ELISA | IL-1β和IL-18 ELISA试剂盒 | eBiosciences | -- |
| 细胞活力检测 | CCK-8细胞计数试剂盒 | Elabscience | E-CK-A362 |
| 细胞毒性检测 | LDH细胞毒性检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | C0017 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher | -- |
| RT-qPCR | PrimeScript RT试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| SYBR Green试剂盒 | TaKaRa | -- | |
| Applied Biosystems 7300实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| 膜蛋白提取 | 细胞膜蛋白与胞浆蛋白提取试剂盒 | beyotime | P0033 |
| Western blot | Na-K-ATP酶抗体 | CST | 3010S |
| IL-1β抗体 | Abcam | ab9722 | |
| IL-18抗体 | Proteintech | 10663-1-AP | |
| Flag抗体 | Proteintech | 20543-1-AP | |
| GAPDH抗体 | Bioworld | MB001 | |
| 电镜观察 | 日立HT7800电子显微镜 | HITACHI | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | 细胞系来源、培养条件；GI-Y2预处理浓度和时间；LPS和nigericin浓度及处理时间 阅读提示：参见Methods 2.4 Cell culture和Figure 1 legend |
| 蛋白结合实验 | GST-GSDMD蛋白浓度、固定条件；SPR缓冲液和DMSO浓度；pull-down中Bio-GI-Y2浓度和孵育时间 阅读提示：参见Methods 2.3 GI-Y2-GSDMD binding assays和Figure 2 legend |
| 动脉粥样硬化模型 | 小鼠品系、性别、年龄；高脂饮食持续时间；GI-Y2给药剂量、途径和频率 阅读提示：参见Methods 2.6 Animal experiment和Figure 3 legend |
| 纳米颗粒制备 | PLGA分子量、丙酮体积、搅拌速度和时间；膜蛋白提取方法；纳米颗粒粒径和药物浓度 阅读提示：参见Methods 2.5 Preparation of macrophage membrane-coated GI-Y2 nanoparticles |
| 统计分析 | 样本量（n值）、重复次数、正态性检验方法、统计检验方法 阅读提示：参见Methods 2.14 Statistical analysis |