建立动脉粥样硬化小鼠模型及ISO给药
评估ISO对动脉粥样硬化进展的影响
ApoE-/-小鼠喂食高脂饮食3个月建立AS模型，从第2个月开始每日腹腔注射ISO（40 mg/kg）持续2个月，对照组喂食正常饮食。
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异荭草素通过降低KDM4A水平并促进SKP1-Cullin1-F-box E3连接酶介导的NLRP3泛素化改善巨噬细胞焦亡和动脉粥样硬化
Isoorientin Ameliorates Macrophage Pyroptosis and Atherogenesis by Reducing KDM4A Levels and Promoting SKP1-Cullin1-F-box E3 Ligase-mediated NLRP3 Ubiquitination.
实验完整度
高包含ApoE-/-小鼠高脂饮食模型、BMDM细胞模型，以及KDM4A/SKP1过表达的功能回复实验，并验证了泛素化及转录调控机制。
主要模型
ApoE-/-小鼠高脂饮食诱导的动脉粥样硬化模型 小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM） ox-LDL诱导的BMDM焦亡模型
重点核对
ISO给药剂量：40 mg/kg每日腹腔注射，持续2个月 BMDM处理条件：ox-LDL 50 μg/mL处理24 h，ISO 40 μM处理24 h KDM4A和SKP1过表达方式：AAV9-F4/80载体尾静脉注射或慢病毒感染BMDM 实验分组：ND、HD、HD+ISO、AAV-oe-NC、AAV-oe-KDM4A、AAV-oe-KDM4A+AAV-oe-NC、AAV-oe-KDM4A+AAV-oe-SKP1，每组n=6 关键检测指标：动脉粥样硬化病变面积、脂质沉积、坏死核心、巨噬细胞焦亡标志物（N-GSDMD、cleaved caspase-1）、炎症因子（IL-18、IL-1β）
摘要
异荭草素（ISO）是一种具有潜在抗氧化和抗动脉粥样硬化特性的黄酮类化合物。本研究探讨了ISO在动脉粥样硬化（AS）进展中对巨噬细胞焦亡的影响，并探讨了其功能机制。采用高脂饮食喂养ApoE–/–小鼠建立AS模型。ISO处理显著减轻了模型小鼠的动脉粥样硬化病变、脂质积累、坏死核心区域和巨噬细胞焦亡。在体外，ISO减少了氧化低密度脂蛋白诱导的小鼠骨髓来源巨噬细胞的焦亡。这些效应的机制与巨噬细胞中赖氨酸去甲基化酶4A（KDM4A）水平的降低有关。人为恢复KDM4A水平逆转了ISO的保护作用并促进了动脉粥样硬化形成。KDM4A被发现抑制S期激酶相关蛋白1（SKP1）的转录，导致SKP1-Cullin1-F-box（SCF）E3连接酶介导的NLR家族pyrin域蛋白3（NLRP3）泛素化受损。这种破坏促进了NLRP3炎症小体的组装和激活。人为过表达SKP1降低了NLRP3水平并逆转了ISO的保护作用。总之，本研究表明ISO通过降低KDM4A水平和恢复SCF复合物介导的NLRP3泛素化来抑制巨噬细胞焦亡和动脉粥样硬化形成。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 异荭草素是否通过调节巨噬细胞焦亡来减轻动脉粥样硬化，其潜在分子机制是什么？
- 核心机制
- ISO通过降低KDM4A水平，解除对SKP1转录的抑制，恢复SCF E3连接酶介导的NLRP3泛素化，从而抑制NLRP3炎症小体组装和激活，减少巨噬细胞焦亡。
- 主要证据
- ApoE-/-小鼠模型中ISO减轻动脉粥样硬化病变和巨噬细胞焦亡；BMDM中ISO抑制ox-LDL诱导的焦亡；KDM4A过表达逆转ISO的保护作用；KDM4A通过去甲基化H3K36me3抑制SKP1转录；SKP1促进NLRP3泛素化并减少其与ASC结合。
- 研究意义
- 研究揭示了ISO通过表观遗传调控抑制巨噬细胞焦亡的新机制，为ISO作为动脉粥样硬化治疗药物提供了理论依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
BMDM细胞培养及焦亡模型建立
在体外验证ISO对巨噬细胞焦亡的影响
从C57BL/6小鼠股骨和胫骨中分离骨髓细胞，用M-CSF诱导分化为BMDM，然后用ox-LDL（50 μg/mL）处理24 h诱导焦亡，同时或随后用ISO（40 μM）处理24 h。
检测ISO对动脉粥样硬化病变和巨噬细胞焦亡的影响
评估ISO对AS病变和巨噬细胞焦亡的抑制作用
通过油红O染色评估主动脉和主动脉根部脂质沉积，HE染色评估坏死核心区域；免疫荧光染色检测F4/80+TUNEL、N-GSDMD、cleaved-caspase-1阳性细胞；ELISA检测血清炎症因子IL-18和IL-1β水平。
验证ISO对KDM4A表达的影响
探讨ISO是否通过降低KDM4A水平发挥作用
通过免疫荧光和Western blot检测KDM4A在主动脉根部和BMDM中的表达；利用慢病毒过表达KDM4A后观察ISO的保护作用是否被逆转。
体内验证KDM4A过表达对ISO疗效的影响
在动物模型中确认KDM4A过表达能否逆转ISO的抗动脉粥样硬化作用
通过AAV9-F4/80载体在巨噬细胞中过表达KDM4A，然后给予ISO治疗，检测动脉粥样硬化病变和巨噬细胞焦亡指标。
探究KDM4A对SKP1转录的调控机制
明确KDM4A是否通过影响组蛋白甲基化调控SKP1表达
通过ChIP-qPCR检测KDM4A、H3K36me3、H3K9me3在SKP1启动子区域的富集；Western blot检测H3K36me3、H3K9me3和SKP1蛋白水平。
验证SKP1对NLRP3泛素化及炎症小体组装的调控
明确SKP1是否通过促进NLRP3泛素化抑制炎症小体组装
通过免疫荧光和co-IP验证NLRP3与SKP1/Cullin1的相互作用；通过泛素化实验检测SKP1对NLRP3泛素化的影响；通过co-IP检测NLRP3与ASC的结合。
验证SKP1过表达对ISO抗焦亡作用的恢复
确认SKP1能否逆转KDM4A过表达引起的ISO保护作用丧失
在BMDM中同时过表达KDM4A和SKP1，然后进行ox-LDL和ISO处理，检测焦亡指标。
体内验证SKP1恢复对ISO疗效的影响
在动物模型中确认SKP1过表达能否恢复ISO的抗动脉粥样硬化作用
在ApoE-/-小鼠中同时过表达KDM4A和SKP1，给予ISO治疗，检测动脉粥样硬化病变和焦亡指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | ApoE-/-小鼠 | Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | -- |
| 细胞培养 | 巨噬细胞集落刺激因子 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 红细胞裂解液 | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| 药物处理 | 异荭草素 | -- | -- |
| 细胞处理 | 氧化低密度脂蛋白 | -- | -- |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 |
| 血脂检测 | 高密度脂蛋白检测试剂盒 | NanJing JianCheng Bioengineering Institute | F003-1-1 |
| 低密度脂蛋白检测试剂盒 | NanJing JianCheng Bioengineering Institute | A113-1-1 | |
| 甘油三酯检测试剂盒 | NanJing JianCheng Bioengineering Institute | A110-1-1 | |
| 总胆固醇检测试剂盒 | NanJing JianCheng Bioengineering Institute | A111-1-1 | |
| 细胞凋亡检测 | TUNEL试剂盒 | Thermo Fisher | C10617 |
| ELISA | IL-18 ELISA试剂盒 | Elabscience Biotechnology Co., Ltd. | E-EL-M0730 |
| IL-1β ELISA试剂盒 | R&D Systems | MLB00C | |
| 免疫组化 | DAB显色试剂盒 | Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd. | G1212-200T |
| 细胞焦亡检测 | Hoechst/PI检测试剂盒 | Yeasen Biotechnology Co., Ltd. | 40744ES60 |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | MCE | HY-K0301 |
| LDH检测 | LDH检测试剂 | Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | C0016 |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Shanghai Sangon Biotech | C500007 |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | PC0020 |
| Western blot | 增强化学发光试剂 | Thermo Fisher | 32209 |
| ChIP | SimpleChIP酶法染色质免疫沉淀试剂盒 | Cell Signaling Technology | 9003 |
| 免疫共沉淀 | Protein A/G琼脂糖珠 | Thermo Fisher | 20422 |
| HA琼脂糖珠 | Thermo Fisher | 26181 | |
| 抗体 | F4/80抗体 | Abcam | ab6640 |
| N-GSDMD抗体 | Affinity Biosciences | DF13758 | |
| cleaved caspase-1抗体 | MedChemExpress | HY-P80622 | |
| KDM4A抗体 | Abcam | ab191433 | |
| SKP1抗体 | Proteintech | 67745-1-Ig | |
| NLRP3抗体 | Proteintech | 30109-1-AP | |
| Cullin1抗体 | Proteintech | 66978-1-Ig | |
| ASC抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-514414 | |
| Alexa Fluor 647山羊抗大鼠二抗 | Thermo Fisher | A-21247 | |
| Alexa Fluor 488山羊抗兔二抗试剂盒 | Thermo Fisher | A31627 | |
| Alexa Fluor 647山羊抗小鼠二抗 | Thermo Fisher | A-21235 | |
| 山羊抗兔IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6721 | |
| caspase-1抗体 | Sigma-Aldrich | ZRB1233 | |
| H3K36me3抗体 | Abcam | ab9050 | |
| H3K9me3抗体 | Abcam | ab8898 | |
| GAPDH抗体 | Abcam | ab8245 | |
| SKP1抗体 | Proteintech | 10990-2-AP | |
| 免疫共沉淀 | IgG抗体 | Abcam | ab172730 |
| 抗体 | Myc抗体 | Abcam | ab9106 |
| Flag抗体 | Cell Signaling Technology | 2368 | |
| 动物实验 | 肝素 | -- | -- |
| 细胞处理 | MCC950 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | ApoE-/-小鼠品系、周龄（8周龄）、性别（雄性）、高脂饮食持续时间（3个月） 阅读提示：见Materials and Methods: Animals |
| ISO给药 | 给药剂量（40 mg/kg）、给药方式（腹腔注射）、给药频率（每日）、给药持续时间（2个月） 阅读提示：见Materials and Methods: Animals |
| 细胞处理 | BMDM分化条件（M-CSF浓度20 ng/mL）、ox-LDL浓度（50 μg/mL）、处理时间（24 h）、ISO浓度（40 μM）、处理时间（24 h） 阅读提示：见Materials and Methods: Isolation and Treatment of BMDMs |
| 基因过表达 | AAV9载体类型（AAV-F4/80）、体内给药方式（尾静脉注射）、慢病毒感染时间（2天） 阅读提示：见Materials and Methods: Animals and Isolation and Treatment of BMDMs |
| 焦亡检测 | Hoechst/PI染色步骤、TUNEL染色步骤、LDH释放检测方法 阅读提示：见Materials and Methods: Immunofluorescence Staining and TUNEL, Hoechst/PI Staining, LDH Release Detection |
| Western blot | 抗体稀释比例、蛋白上样量、封闭条件（3%脱脂牛奶） 阅读提示：见Materials and Methods: Western Blotting Analysis |
| ChIP-qPCR | 甲醛交联时间、超声处理条件、抗体使用量 阅读提示：见Materials and Methods: ChIP-qPCR |
| 泛素化检测 | 质粒种类（Flag-SKP1、HA-NLRP3、Myc-Ub）、转染试剂（Lipofectamine 3000）、转染时间（48 h） 阅读提示：见Materials and Methods: Ubiquitination Assessment |
| 统计方法 | t检验或ANOVA的使用条件、事后检验方法（Tukey）、显著性阈值（p<0.05） 阅读提示：见Materials and Methods: Statistical Analysis |