整合单细胞RNA测序揭示食管胃交界处腺癌肝转移过程中的肿瘤异质性和微环境景观

Integrated single-cell RNA sequencing reveals the tumor heterogeneity and microenvironment landscape during liver metastasis in adenocarcinoma of esophagogastric junction.

作者信息Junrui Xu, Ussama Sadiq, Wangruizhi Zhao, Hengbo Xia, Yiwei Liu, Renquan Zhang, Aman Xu
PMID39850884
发布时间2025-01-09
DOI10.3389/fimmu.2024.1484234

实验完整度

中

包含单细胞测序、公共数据库分析、空间转录组和免疫荧光验证,但缺乏功能实验和动物模型,且样本量小。

主要模型

AEGJ原发肿瘤组织及配对正常组织 GSE206785公共单细胞数据(含AEGJ、胃体癌、胃窦癌) TCGA-STAD数据(远处转移和淋巴转移样本) GSE203612空间转录组数据

重点核对

单细胞样本:2例AEGJ肝转移患者原发灶及正常组织,另10例AEGJ样本 公共数据GSE206785:2例AEGJ、2例胃体癌、1例胃窦癌 免疫荧光验证SFRP2、IL24、JUND表达 TCGA-STAD中SFRP2高表达与不良预后相关

摘要

背景:食管胃交界处腺癌(AEGJ)是一种高度侵袭性肿瘤,经常转移至肝脏。理解驱动这一过程的细胞和分子机制对于开发有效疗法至关重要。方法:我们采用单细胞RNA测序分析AEGJ肝转移患者的肿瘤异质性和微环境景观。该方法使我们能够表征参与肝转移过程的不同细胞群体。结果:我们的分析揭示了成纤维细胞和壁细胞在AEGJ肝转移中的显著参与。我们在AEGJ肝转移中鉴定出一种特定的成纤维细胞类型,并观察到食管胃交界处腺癌与其他胃腺癌之间的不同基因表达模式。我们的研究表明,在AEGJ肝转移过程中,SFRP2基因在周细胞中高表达。GEO、TCGA和SFRP2表达的免疫荧光染色的结合增强了我们的研究。周细胞中SFRP2的高表达可能通过Wnt通路影响血管稳定性和血管生成。结论:我们的研究为AEGJ肝转移的细胞相互作用和分子机制提供了新的见解。靶向已鉴定的成纤维细胞亚型或影响周细胞中的SFRP2基因表达可能为对抗这种侵袭性肿瘤提供新的治疗策略。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
AEGJ肝转移的细胞和分子机制是什么?
核心机制
SFRP2在周细胞中高表达可能通过Wnt通路影响血管稳定性和血管生成,从而促进AEGJ肝转移;特定成纤维细胞亚群(F4)及其基因IL24和JUND可能通过细胞-基质相互作用影响肝转移。
主要证据
基于scRNA-seq、GEO/TCGA数据分析、空间转录组和免疫荧光染色,发现SFRP2在AEGJ肝转移中周细胞高表达,且与不良预后相关。
研究意义
为AEGJ肝转移提供新的治疗靶点,可能用于患者分层和个体化治疗。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

样本收集与单细胞转录组测序

获取AEGJ肝转移原发灶及正常组织的单细胞转录组图谱。

收集2例可手术AEGJ肝转移患者的原发肿瘤及癌旁正常组织,进行scRNA-seq;另收集10例AEGJ样本。

2

公共数据整合与细胞聚类分析

扩大样本量,比较不同胃腺癌亚部位的细胞组成差异。

整合GSE206785公共数据和自测数据,进行质量控制、归一化、整合、降维和聚类,注释为10种主要细胞类型。

3

成纤维细胞亚群分析

鉴定AEGJ肝转移相关的成纤维细胞亚群及其分子特征。

对成纤维细胞进行再聚类,获得8个亚群,比较各亚群在不同样本中的比例,并对特征基因进行功能富集分析。

4

AEGJ肝转移成纤维细胞差异基因分析

识别驱动F4亚群在肝转移中扩增的关键基因。

比较AEGJ肝转移与非转移样本中F4亚群的特征基因,筛选差异表达基因,并使用公共数据验证。

5

功能分析

探索IL24和JUND在AEGJ肝转移中的潜在功能。

使用TCPA、KEGG、GSVA等数据库分析IL24和JUND与癌症相关通路的关系。

6

壁细胞亚群分析

探究壁细胞在AEGJ肝转移中的作用。

对壁细胞进行再聚类,获得6个亚群,进行拟时间分析,发现M2亚群可能分化为成纤维细胞。

7

SFRP2+周细胞分析

鉴定AEGJ肝转移相关的壁细胞标志基因。

比较AEGJ肝转移与非转移组壁细胞的差异基因,与TCGA-STAD转移数据取交集,筛选出SFRP2,并通过免疫荧光验证其定位。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

单细胞转录组分析
数据整合与差异表达分析
轨迹分析
免疫荧光染色

产品清单

实验环节名称品牌货号
DMEM培养基HYCLONESH30406.05
gentleMACS C管Miltenyi Biotec130-096-334
酶解液Miltenyi Biotec130-095-929
组织处理器Miltenyi Biotec130-096-427
40 μm细胞筛网BD352340
红细胞裂解液QIAGEN8570396
死细胞去除试剂盒Miltenyi Biotec130-090-101
磷酸盐缓冲液GIBCO10010-031
MGI1SEQ-2000RS高通量测序试剂盒MGI1000012554
Chromium控制器10x Genomics--
热循环仪S100Bio-RadS100
基因测序仪MGISEQ-2000MGIMGISEQ-2000
抗DCN抗体ProteintechAg6275,
抗ACTA2抗体HUABIOET1607-53
抗IL24抗体HUABIOER1911-33
抗JUND抗体HUABIOET1612-92
抗SFRP2抗体ProteintechAg18840,
FITC标记二抗ElabscienceE-AB-1015
Cyanine3标记二抗ElabscienceE-AB-1010
Leica DMi8S共聚焦激光扫描显微镜LeicaDMi8S

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
患者样本纳入标准
纳入2例可手术AEGJ肝转移患者,需满足肿瘤浸润深度≤T4a、淋巴结转移在D2范围内、寡转移(1-3个转移灶局限于同一肝叶)等条件;另收集10例AEGJ样本。
阅读提示:方法部分‘患者与样本收集’及‘组织解离和单细胞悬液制备’
单细胞测序
细胞密度1000 cells/μL,每个样本细胞数≥10,000,细胞活力>90%,cDNA扩增11个循环,采用MGISEQ-2000测序平台,双端150bp。
阅读提示:方法部分‘文库构建和单细胞测序’
免疫荧光染色
4μm切片,抗原修复(柠檬酸缓冲液pH6.0,15分钟),一抗(anti-DCN 1:1000, anti-ACTA2 1:100, anti-IL24 1:100, anti-JUND 1:50, anti-SFRP2 1:750),二抗(FITC和Cyanine3),DAPI染色。
阅读提示:方法部分‘免疫荧光染色’