样本收集与单细胞转录组测序
获取AEGJ肝转移原发灶及正常组织的单细胞转录组图谱。
收集2例可手术AEGJ肝转移患者的原发肿瘤及癌旁正常组织,进行scRNA-seq;另收集10例AEGJ样本。
Integrated single-cell RNA sequencing reveals the tumor heterogeneity and microenvironment landscape during liver metastasis in adenocarcinoma of esophagogastric junction.
包含单细胞测序、公共数据库分析、空间转录组和免疫荧光验证,但缺乏功能实验和动物模型,且样本量小。
AEGJ原发肿瘤组织及配对正常组织 GSE206785公共单细胞数据(含AEGJ、胃体癌、胃窦癌) TCGA-STAD数据(远处转移和淋巴转移样本) GSE203612空间转录组数据
单细胞样本:2例AEGJ肝转移患者原发灶及正常组织,另10例AEGJ样本 公共数据GSE206785:2例AEGJ、2例胃体癌、1例胃窦癌 免疫荧光验证SFRP2、IL24、JUND表达 TCGA-STAD中SFRP2高表达与不良预后相关
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获取AEGJ肝转移原发灶及正常组织的单细胞转录组图谱。
收集2例可手术AEGJ肝转移患者的原发肿瘤及癌旁正常组织,进行scRNA-seq;另收集10例AEGJ样本。
扩大样本量,比较不同胃腺癌亚部位的细胞组成差异。
整合GSE206785公共数据和自测数据,进行质量控制、归一化、整合、降维和聚类,注释为10种主要细胞类型。
鉴定AEGJ肝转移相关的成纤维细胞亚群及其分子特征。
对成纤维细胞进行再聚类,获得8个亚群,比较各亚群在不同样本中的比例,并对特征基因进行功能富集分析。
识别驱动F4亚群在肝转移中扩增的关键基因。
比较AEGJ肝转移与非转移样本中F4亚群的特征基因,筛选差异表达基因,并使用公共数据验证。
探索IL24和JUND在AEGJ肝转移中的潜在功能。
使用TCPA、KEGG、GSVA等数据库分析IL24和JUND与癌症相关通路的关系。
探究壁细胞在AEGJ肝转移中的作用。
对壁细胞进行再聚类,获得6个亚群,进行拟时间分析,发现M2亚群可能分化为成纤维细胞。
鉴定AEGJ肝转移相关的壁细胞标志基因。
比较AEGJ肝转移与非转移组壁细胞的差异基因,与TCGA-STAD转移数据取交集,筛选出SFRP2,并通过免疫荧光验证其定位。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 单细胞悬液制备 | DMEM培养基 | HYCLONE | SH30406.05 |
| gentleMACS C管 | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| 酶解液 | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| 组织处理器 | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| 40 μm细胞筛网 | BD | 352340 | |
| 红细胞裂解液 | QIAGEN | 8570396 | |
| 死细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| 磷酸盐缓冲液 | GIBCO | 10010-031 | |
| 单细胞测序 | MGI1SEQ-2000RS高通量测序试剂盒 | MGI | 1000012554 |
| Chromium控制器 | 10x Genomics | -- | |
| 热循环仪S100 | Bio-Rad | S100 | |
| 基因测序仪MGISEQ-2000 | MGI | MGISEQ-2000 | |
| 免疫荧光染色 | 抗DCN抗体 | Proteintech | Ag6275, |
| 抗ACTA2抗体 | HUABIO | ET1607-53 | |
| 抗IL24抗体 | HUABIO | ER1911-33 | |
| 抗JUND抗体 | HUABIO | ET1612-92 | |
| 抗SFRP2抗体 | Proteintech | Ag18840, | |
| FITC标记二抗 | Elabscience | E-AB-1015 | |
| Cyanine3标记二抗 | Elabscience | E-AB-1010 | |
| Leica DMi8S共聚焦激光扫描显微镜 | Leica | DMi8S |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本纳入标准 | 纳入2例可手术AEGJ肝转移患者,需满足肿瘤浸润深度≤T4a、淋巴结转移在D2范围内、寡转移(1-3个转移灶局限于同一肝叶)等条件;另收集10例AEGJ样本。 阅读提示:方法部分‘患者与样本收集’及‘组织解离和单细胞悬液制备’ |
| 单细胞测序 | 细胞密度1000 cells/μL,每个样本细胞数≥10,000,细胞活力>90%,cDNA扩增11个循环,采用MGISEQ-2000测序平台,双端150bp。 阅读提示:方法部分‘文库构建和单细胞测序’ |
| 免疫荧光染色 | 4μm切片,抗原修复(柠檬酸缓冲液pH6.0,15分钟),一抗(anti-DCN 1:1000, anti-ACTA2 1:100, anti-IL24 1:100, anti-JUND 1:50, anti-SFRP2 1:750),二抗(FITC和Cyanine3),DAPI染色。 阅读提示:方法部分‘免疫荧光染色’ |