动物模型建立与基因型鉴定
建立FBXO45过表达和野生型小鼠，并确认基因型。
繁殖FBXO45-OE小鼠并剪尾提取DNA进行PCR基因分型，鉴定阳性小鼠。
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FBXO45介导的纤维化和肝肿瘤发生在化学诱导的小鼠肝细胞癌模型中的体内分析
In vivo analysis of FBXO45-mediated fibrosis and liver tumorigenesis in a chemically induced mouse model of hepatocellular carcinoma.
实验完整度
中该方案包含化学诱导小鼠模型、组织病理学（H&E、IHC）和基因表达分析（qRT-PCR）等实验层级，但主要侧重于方法描述，缺乏机制验证和体内功能验证。
主要模型
FBXO45过表达转基因小鼠（FBXO45-OE，C57BL/6J背景） 野生型C57BL/6J小鼠 DEN/CCl4诱导的肝细胞癌小鼠模型
重点核对
小鼠品系：C57BL/6J，雄性，FBXO45-OE及野生型，4周龄 化学诱导：2周龄时单次腹腔注射DEN（25 mg/kg），4周龄时每周两次腹腔注射CCl4（0.5 mL/kg，20%橄榄油溶液），持续14周，之后观察6周 组织采集：肝脏分离，肿瘤计数和最大直径测量（用游标卡尺），组织固定于10%福尔马林，RNA样品液氮速冻 qRT-PCR分析：使用TB Green Premix Ex Taq II，GAPDH作为内参，2^-ΔΔCt法计算相对表达 病理评估：H&E染色和IHC（anti-FBXO45 1:300, anti-Ki67 1:800）
摘要
FBXO45是一种在肝肿瘤中高表达的E3泛素连接酶，与肝细胞癌（HCC）患者的不良生存正相关，但FBXO45是否驱动HCC肿瘤发生仍不清楚。在此，我们描述了一种缩短HCC肿瘤发生观察期的方案，以评估FBXO45在DEN/CCl4诱导的HCC小鼠模型中的作用。我们描述了在FBXO45过表达小鼠中化学诱导HCC的步骤，随后通过定量实时PCR、组织学和免疫组织化学进行组织收集和病理评估。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FBXO45是否驱动肝细胞癌的发生，以及其在DEN/CCl4诱导的小鼠模型中的作用机制。
- 核心机制
- FBXO45通过加速炎症和纤维化促进肝肿瘤发生。
- 主要证据
- 在DEN/CCl4处理下，FBXO45-OE小鼠比WT小鼠出现更多肿瘤和更高的肝重比；纤维化相关基因（Acta2, Timp1, Col1a1, Col1a2, Pdgfb, Pdgfrb）和炎症标志物（Il6, Il1b, Tnfa, Ccl2）表达增加；IHC显示Ki67表达增加；H&E染色显示炎性浸润和细胞排列紊乱。
- 研究意义
- 文中未明确说明。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
DEN/CCl4化学诱导HCC
诱导小鼠产生肝纤维化和肝细胞癌。
14日龄小鼠腹腔注射DEN，4周龄开始每周两次CCl4注射，持续14周，然后观察6周。
组织采集与肿瘤评估
收集肝脏组织并评估肿瘤数量、大小及肝脏重量。
处死小鼠，分离肝脏，冲洗，观察并计数肉眼可见肿瘤，测量最大直径，记录体重、肝重、肿瘤数和转移情况，并采集组织用于后续分析。
RNA提取和qRT-PCR分析
检测纤维化和炎症相关基因的表达水平。
从肝组织提取总RNA，逆转录合成cDNA，通过qRT-PCR检测纤维化相关基因（Acta2, Timp1, Col1a1, Col1a2, Pdgfb, Pdgfrb）和炎症因子（Il6, Il1b, Tnfa, Ccl2）的表达。
组织病理学分析
评估肝脏组织的形态学和蛋白质表达变化。
对肝组织切片进行H&E染色以观察病理变化，通过IHC检测FBXO45和Ki67蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
验证免疫效应
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 化学诱导 | 橄榄油 | Sangon Biotech | A502795 |
| 0.9%氯化钠溶液 | Southwest Pharmaceutical | -- | |
| 组织处理 | 10%中性缓冲福尔马林 | Sigma | HT501128 |
| RNA提取 | RNAiso Plus试剂 | Takara | 9108 |
| 麻醉 | 异氟烷 | Sigma | PHR2874 |
| RNA提取 | 氯仿 | Nanjing Reagent | C0761520224 |
| 异丙醇 | Macklin | I811925 | |
| DEPC水 | Sangon Biotech | B501005-0500 | |
| H&E染色 | 苏木素染色液 | Biosharp | BL702B |
| 伊红染色液 | Biosharp | BL703B | |
| IHC | 柠檬酸钠抗原修复液（50×） | Solarbio | C1032 |
| 过氧化氢 | Elabscience | E-IR-R115 | |
| H&E染色 | 甲醇 | Macklin | M813895 |
| 二甲苯 | Macklin | X820585 | |
| 乙醇 | Macklin | E809061 | |
| 中性树胶 | Biosharp | BL704A | |
| 组织包埋 | 石蜡 | Aladdin | P100928 |
| 组织处理 | 1×PBS缓冲液 | BBI life sciences | E607008 |
| 基因分型 | 小鼠直接PCR试剂盒 | Bimake | B40013 |
| RT-qPCR | PrimeScript RT试剂盒（含gDNA Eraser） | Takara | RR047 |
| TB Green Premix Ex Taq II | Takara | RR820 | |
| IHC | DAB显色试剂盒（20×） | Zsgb-Bio | ZLI-9019 |
| 免疫组织化学检测试剂盒 | Zsgb-Bio | SP-9001 | |
| 兔抗FBXO45抗体 | Bioss | bs-13150R | |
| 小鼠抗Ki67抗体 | Millipore | FCMAB103AP | |
| 注射 | 1毫升注射器 | Huayon | 21-3026 |
| 组织冲洗 | 50毫升注射器 | Huayon | 21-3020 |
| 样品保存 | 1.5毫升离心管 | Axygen | MCT-150-C |
| 溶液配制 | 50毫升离心管 | Nest | 602052 |
| 解剖 | 解剖剪 | Huayon | 18-0110 |
| 镊子 | Huayon | 18-1240 | |
| 混匀 | 振荡器 | Kylin-Bell | VORTEX-6 |
| 组织包埋 | 组织包埋模具 | Citotest | 31050106W |
| 切片 | 载玻片 | Citotest | 188105W |
| 盖玻片 | Citotest | 10212450C | |
| IHC | 组化笔 | Zsgb-Bio | -- |
| 肿瘤测量 | 游标卡尺 | Asoyoga | ASJ-424 |
| 止血 | 止血棉 | -- | -- |
| 组织匀浆 | 组织匀浆器 | Tiangen | OSE-Y30 |
| 称重 | 电子分析天平 | Sartorius | BSA124S-CW |
| 显微镜观察 | 显微镜（BX41） | Olympus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物准备与基因分型 | 小鼠品系（C57BL/6J）、性别（雄性）、周龄（4周）、基因型（FBXO45-OE或WT）、PCR引物序列及条件 阅读提示：Before you begin: Preparation of animals, Preparation of genotyping, Key resources table |
| DEN/CCl4诱导 | DEN剂量（25 mg/kg）、注射途径（腹腔）、注射时间（14日龄）；CCl4剂量（0.5 mL/kg）、浓度（20%橄榄油）、注射频率（每周两次，14周）、观察期（6周）；对照组（盐水/橄榄油） 阅读提示：Step-by-step method details: DEN/CCl4-induced HCC animal model |
| 组织采集 | 麻醉方式、处死方法、肝脏处理（冲洗、固定）、肿瘤计数和测量方法 阅读提示：Step-by-step method details: Tissue sample collection |
| RNA提取和qRT-PCR | RNA提取试剂和步骤、qPCR引物序列、内参基因（GAPDH）、技术重复数（3）、分析方法（2^-ΔΔCt） 阅读提示：Step-by-step method details: RNA isolation and quantitative real-time PCR, Key resources table |
| 组织病理学 | 切片厚度（5 μm）、抗原修复条件（10 mM柠檬酸钠，高压2.5分钟）、抗体稀释度（FBXO45 1:300，Ki67 1:800）、染色步骤（H&E和IHC） 阅读提示：Step-by-step method details: Hematoxylin and eosin staining, Immunohistochemistry staining assay |