质粒制备
获得表达SARS-CoV-2 S蛋白和VLP包装所需质粒
将pCAGGS-SWH或pCAGGS-SDel质粒转化DH5α感受态细胞，进行Midi-prep提取，并准备VLP包装所需质粒（如pCMVΔ8.2、pUNO1-SARS2-E等）。
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评估SARS-CoV-2刺突蛋白假病毒样颗粒诱导人巨噬细胞炎症反应的实验方案
Protocol to evaluate the inflammatory response in human macrophages induced by SARS-CoV-2 spike-pseudotyped VLPs.
实验完整度
中方案包含VLP生产与表征、细胞处理及细胞因子检测等明确实验步骤，但无具体结果数据或机制验证。
主要模型
人单核细胞来源巨噬细胞（hMDMs） 293T细胞
重点核对
HIV-PVLP处理hMDMs的p24蛋白量（20 ng） SARS2-VLP处理hMDMs的S蛋白量（10 ng） hMDMs分化时M-CSF浓度（10-50 ng/mL）及分化时间（6-7天） VLP或PVLP的S蛋白掺入效率（S/N或S/p24比值） 细胞因子检测的生物学重复数（2或3个重复孔）
摘要
COVID-19患者中促炎细胞因子的过度释放对器官有害。SARS-CoV-2刺突蛋白（S）对炎症反应的贡献对于理解其发病机制和毒力至关重要。在此，我们提出一个实验方案，用于生产和表征基于HIV和SARS-CoV-2的病毒样颗粒，然后评估SARS-CoV-2原始株和Delta变异株的S蛋白在人巨噬细胞中产生的炎症细胞因子的蛋白和mRNA水平。该方案适用于评估不同新出现变异株的S蛋白。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何评估SARS-CoV-2刺突蛋白（S）诱导人巨噬细胞产生炎症细胞因子的能力？
- 核心机制
- 文中未明确说明具体机制，但方案旨在通过检测S蛋白诱导的细胞因子表达来反映其炎症反应。
- 主要证据
- 该方案通过HIV-和SARS-CoV-2-based VLPs处理hMDMs，利用MSD免疫分析和RT-qPCR分别检测细胞因子蛋白和mRNA水平，但未提供具体实验数据。
- 研究意义
- 该方案可用于评估不同SARS-CoV-2变异株的S蛋白诱导的炎症反应，有助于理解其发病机制和毒力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞准备
准备293T细胞用于VLP生产，并分化人类单核细胞为巨噬细胞
复苏和培养293T细胞，接种于10 cm皿；从健康供体外周血分离PBMCs，用M-CSF诱导单核细胞分化为hMDMs。
VLP生产与纯化
生产并纯化SARS2-VLP和HIV-PVLP颗粒
用PEI共转染293T细胞生产SARS2-VLP（含N、M、E、S质粒）和HIV-PVLP（含pCMVΔ8.2和S质粒），收集上清，通过超速离心纯化。
VLP表征
验证VLP中蛋白表达和S掺入效率
通过Western blot检测S、N和p24蛋白，并通过ELISA定量S蛋白和p24蛋白。
巨噬细胞处理与细胞因子检测
评估S蛋白诱导hMDMs产生炎症细胞因子的蛋白和mRNA水平
用HIV-PVLP或SARS2-VLP处理hMDMs，收集上清测蛋白，提取RNA测mRNA。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 质粒制备 | PureLink HiPure质粒中提试剂盒 | Invitrogen | K210004 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11995065 |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | 11875093 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 26140079 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| PBMC分离 | Lymphoprep淋巴细胞分离液 | Axis-Shield Poc As | 1114547 |
| 巨噬细胞分化 | 巨噬细胞集落刺激因子 | R&D System | 416-ML-010 |
| 转染 | 聚乙烯亚胺 | Sigma-Aldrich | 408727 |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000001 | |
| VLP纯化 | Opti-MEM减血清培养基 | Gibco | 31985062 |
| Western blot | Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
| 4× Laemmli样品缓冲液 | Bio-Rad | 1610747 | |
| ECL Western印迹底物 | Promega | W1001 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Promega | G6521 | |
| ELISA定量 | Pierce BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Scientific | 23227 |
| 人SARS-CoV-2 RBD ELISA试剂盒 | Thermo Scientific | EH492RB | |
| HIV p24抗原捕获检测试剂盒 | NCI | -- | |
| 细胞因子蛋白检测 | V-PLEX促炎因子Panel 1（人）试剂盒 | Meso Scale Discovery | K15049D-1 |
| RNA提取 | PureLink RNA小提试剂盒 | Invitrogen | 12183020 |
| 逆转录 | SuperScript VILO反转录预混液 | Invitrogen | 11755050 |
| qPCR | PowerUp SYBR Green预混液 | Applied Biosystems | A25742 |
| 质粒制备 | Nanodrop One分光光度计 | Thermo Scientific | -- |
| 超速离心 | Beckman Coulter超速离心机XPN | Beckman Coulter | A94468 |
| Western blot | Western Blot成像仪MicroChemi | DNR Bio Imaging Systems | MicroChemi |
| ELISA定量 | 酶标仪SpectraMax | Molecular Devices | M3 |
| 细胞因子蛋白检测 | Meso QuickPlex SQ 120MM检测仪 | Meso Scale Discovery | AI1AA-0 |
| qPCR | 实时荧光定量PCR仪Stratagene MX3000P | Agilent | MX3000P |
| 抗体（WB） | 兔抗SARS-CoV-2 SP/RBD多克隆抗体 | Sino Biological | 40592-T62 |
| 重组人抗SARS-CoV-2 S-NTD抗体 | Elabscience | E-AB-V1030 | |
| 兔抗HIV-1 SF2 p24多克隆抗血清 | NIH HIV Reagent Program | ARP-4250 | |
| 驴抗兔IgG-HRP二抗 | GE Healthcare | NA934 | |
| 绵羊抗小鼠IgG-HRP二抗 | GE Healthcare | NA931 | |
| 绵羊抗人IgG-HRP二抗 | GE Healthcare | NA933 | |
| 小鼠抗SARS-CoV-2 Spike RBD单克隆抗体 | R&D Systems | MAB105401 | |
| 兔抗SARS-CoV-2核蛋白单克隆抗体 | Sino Biological | 40143-R019 | |
| 质粒构建 | pCAGGS-SARS2-SWH质粒 | -- | -- |
| pCAGGS-SPΔCDelta质粒 | -- | -- | |
| VLP包装 | pCMVΔ8.2质粒 | Addgene | 12263 |
| pUNO1-SARS2-E质粒 | Sino Biological Inc. | puno1-cov2-e | |
| pUNO1-SARS2-M质粒 | Sino Biological Inc. | puno1-cov2-m | |
| pCMV3-SARS2-NP-myc质粒 | Sino Biological Inc. | VG40588-CM |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 质粒制备 | 质粒浓度（1 μg/μL），DH5α转化条件（热激42°C 1 min），培养时间（8-18小时） 阅读提示：参见Before you begin部分，具体步骤1-2 |
| 细胞准备 | 293T细胞接种密度（1.8-2.5×10^6/皿），hMDMs分化时M-CSF浓度（10-50 ng/mL）和分化时间（6-7天） 阅读提示：参见Before you begin部分，步骤4-5 |
| VLP生产 | 转染质粒DNA量（SARS2-VLP: N 6.7 μg, M 3.3 μg, E 3.3 μg, S 2.5 μg；HIV-PVLP: pCMVΔ8.2 5.0 μg, S 2.5 μg），PEI与DNA比例（1.1 μL/μg DNA），收集上清时间（48h和72h） 阅读提示：参见Step-by-step method details步骤1和4 |
| VLP纯化 | 超速离心参数（SARS2-VLP: 100,000-120,000 × g, 4°C, 3h；HIV-PVLP: 90,000 × g, 4°C, 1.5h） 阅读提示：参见Step-by-step method details步骤2和5 |
| 巨噬细胞处理 | VLP处理量（HIV-PVLP: 20 ng p24；SARS2-VLP: 10 ng S），处理时间（HIV-PVLP: 24h；SARS2-VLP: 20h） 阅读提示：参见Step-by-step method details步骤19和25 |