小鼠HIRI模型建立及药物预处理效果评估
建立肝缺血再灌注损伤模型，评估利拉鲁肽和GLP-1(9-37)对肝脏损伤的保护作用。
雄性C57BL/6小鼠随机分组，分别给予利拉鲁肽、GLP-1(9-37)、GLP-1(28-37)预处理，然后建立70%肝缺血60分钟、再灌注6小时的模型，检测血清ALT、AST水平，进行H&E染色和TUNEL染色评估肝损伤和细胞凋亡。
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利拉鲁肽和GLP-1(9-37)通过GSK3β/Nrf2通路和SMAD159/Hepcidin/FTH通路抑制铁死亡减轻肝缺血再灌注损伤
Liraglutide and GLP-1(9-37) alleviated hepatic ischemia-reperfusion injury by inhibiting ferroptosis via GSK3β/Nrf2 pathway and SMAD159/Hepcidin/FTH pathway.
实验完整度
高包含体内小鼠模型（WT和GLP-1R敲除）、体外Hep-G2细胞模型，以及功能验证（Fer-1、高铁饮食、ML385、LDN193189等）和机制验证（Western blot、qPCR、IF、IHC、TEM等）。
主要模型
C57BL/6小鼠肝缺血再灌注模型 GLP-1R敲除小鼠肝缺血再灌注模型 Hep-G2细胞缺氧复氧模型
重点核对
利拉鲁肽和GLP-1(9-37)的给药剂量：200 μg/kg皮下注射 小鼠肝缺血再灌注模型：缺血60分钟，再灌注6小时 Hep-G2细胞缺氧复氧模型：缺氧48小时，复氧6小时；药物浓度25 μmol/L GLP-1R敲除小鼠的使用及鉴定 铁死亡相关指标：铁含量、脂质过氧化、GPX4、COX2等
摘要
铁死亡在缺血再灌注损伤（IRI）的发病机制中发挥关键作用。利拉鲁肽作为GLP-1受体（GLP-1R）激动剂，除降糖作用外还表现出广泛的生物学效应。近期研究揭示了利拉鲁肽对铁死亡的调节作用，但确切机制仍不清楚。GLP-1(9-37)作为GLP-1的代谢产物，对GLP-1R亲和力低，其对铁死亡的作用尚不清楚。本研究探讨了利拉鲁肽和GLP-1(9-37)对肝缺血再灌注（I/R）中铁死亡的影响及具体机制。我们发现，利拉鲁肽给药减轻了I/R诱导的肝损伤，铁蓄积和脂质过氧化减少，且不完全依赖GLP-1R的存在。同样，GLP-1(9-37)也表现出这些效应。此外，两者均增加GPX4表达并降低COX2表达，这些效应被高铁饮食逆转。体外研究显示类似结果。机制研究中，我们发现利拉鲁肽和GLP-1(9-37)处理通过抑制GSK-3β促进Nrf2核转位，从而减少脂质过氧化物。此外，它们通过SMAD159/Hepcidin通路增加FTH和FTL表达，这有助于减少铁蓄积。总之，本研究确定利拉鲁肽和GLP-1(9-37)通过激活GSK3β/Nrf2通路和SMAD159/Hepcidin/FTH通路抑制铁死亡，从而减轻肝缺血再灌注损伤（HIRI）。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 利拉鲁肽及其代谢物GLP-1(9-37)是否能通过抑制铁死亡减轻肝缺血再灌注损伤，及其具体机制是什么？
- 核心机制
- 利拉鲁肽和GLP-1(9-37)通过抑制GSK3β活性（促进Ser9磷酸化）促进Nrf2核转位，增强抗氧化酶表达，减少脂质过氧化；同时通过激活SMAD159/Hepcidin通路增加FTH和FTL表达，减少细胞内铁蓄积，从而抑制铁死亡。
- 主要证据
- 在小鼠HIRI模型和Hep-G2细胞H/R模型中，利拉鲁肽和GLP-1(9-37)降低铁和脂质过氧化水平，增加GPX4表达，并通过抑制剂（ML385、LDN193189、Hepcidin拮抗剂）和GLP-1R敲除小鼠验证了机制通路。
- 研究意义
- 该研究揭示了利拉鲁肽和GLP-1(9-37)对铁代谢的影响，为其生物学效应提供了新视角，提示利拉鲁肽有望进一步应用于与铁代谢紊乱相关的肝病治疗，GLP-1(9-37)也具有显著的临床转化潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
铁死亡在HIRI中的验证及药物对铁死亡指标的影响
验证铁死亡在HIRI中的作用，并评估利拉鲁肽和GLP-1(9-37)对铁死亡标志物的影响。
使用铁死亡抑制剂Fer-1验证铁死亡参与，然后检测各组小鼠肝脏中的ROS、脂质过氧化、Fe2+、MDA、GSH、SOD水平以及GPX4、COX2、NOX4、4-HNE蛋白表达和PTGS2、ALOX12 mRNA水平，并通过透射电镜观察线粒体形态。
高铁饮食对药物保护作用的影响
通过高铁饮食加重铁死亡，验证利拉鲁肽和GLP-1(9-37)的保护作用是否依赖于抑制铁死亡。
给小鼠喂食含2%羰基铁的高铁饮食14天，然后进行HIRI建模和药物预处理，检测肝组织总铁含量、血清ALT/AST、H&E染色和TUNEL染色。
GLP-1R敲除小鼠验证GLP-1R非依赖性途径
验证利拉鲁肽和GLP-1(9-37)的抗铁死亡作用是否不依赖于GLP-1R。
使用GLP-1R敲除（GLP-1R-/-）小鼠建立HIRI模型，给予与WT小鼠相同的药物预处理，检测ROS、脂质过氧化、Fe2+、MDA、GSH、SOD以及GPX4、COX2、4-HNE蛋白表达。
Hep-G2细胞缺氧复氧模型建立及药物保护作用评估
在体外模拟缺血再灌注，评估利拉鲁肽和GLP-1(9-37)对肝细胞损伤的保护作用。
Hep-G2细胞进行缺氧48小时复氧6小时处理，期间给予药物处理，通过CCK-8检测细胞活力，LDH释放检测细胞损伤。
体外铁死亡指标及机制验证
验证利拉鲁肽和GLP-1(9-37)对H/R诱导的铁死亡的影响。
检测细胞内ROS、线粒体ROS、脂质过氧化、Fe2+、MDA、GSH、SOD、GPX4、COX2蛋白表达，PTGS2和ALOX15 mRNA水平，以及线粒体膜电位（JC-1）。
Nrf2核转位机制探索
阐明利拉鲁肽和GLP-1(9-37)如何通过Nrf2通路减少脂质过氧化。
检测Nrf2总蛋白、核/浆分布，下游抗氧化酶NQO1、HO-1、SOD表达；使用Nrf2抑制剂ML385体内验证；使用核输入抑制剂SN50和核输出抑制剂Leptomycin B探讨Nrf2核丰度增加的原因；检测GSK3β磷酸化水平；使用DIF-3抑制GSK3β磷酸化；分子对接和免疫共沉淀（IP）验证GLP-1R/GSK3β相互作用。
铁代谢相关蛋白表达分析
探讨利拉鲁肽和GLP-1(9-37)降低细胞内铁水平的机制。
检测铁代谢蛋白FTH、FTL、TfR1、DMT1、FPN、Hepcidin、IRP1、IRP2、NCOA4等的表达，以及铁蛋白自噬相关蛋白LC3、P62。
SMAD159/Hepcidin通路验证
验证利拉鲁肽和GLP-1(9-37)是否通过SMAD159/Hepcidin通路增加FTH和FTL表达。
使用Hepcidin拮抗剂-1阻断Hepcidin功能，检测FTH和FTL表达及细胞保护作用；使用LDN193189抑制SMAD159通路，检测Hepcidin、FTH、FTL表达；检测SMAD159、SMAD4、STAT3/p-STAT3表达及下游基因SMAD7、Id1；分子对接和IP验证GLP-1R/SMAD159相互作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 利拉鲁肽 | Novo Nordisk | -- |
| 药物处理 | GLP-1(9-37) | NJPeptide | -- |
| Ferrostatin-1 | Sigma-Aldrich | SML0583 | |
| ML385 | Proteintech | CM05324 | |
| LDN193189 | TargetMol | T1935 | |
| 细胞培养 | MEM培养基 | Bio-Channel | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 肝损伤检测 | 自动生化分析仪(BS-200) | Mindray | -- |
| TUNEL染色 | TUNEL检测试剂盒 | Vazyme Biotech Co.,Ltd | A113-01 |
| ROS检测 | DHE探针 | Sigma-Aldrich | D7008-10 |
| DCFH-DA探针 | Beyotime Institute of Biotechnology | S0033S | |
| MitoSOX红色试剂盒 | Beyotime Institute of Biotechnology | S0061S | |
| 氧化应激指标检测 | 丙二醛检测试剂盒 | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | -- |
| 谷胱甘肽检测试剂盒 | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | -- | |
| 超氧化物歧化酶检测试剂盒 | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | -- | |
| 亚铁离子检测试剂盒 | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | -- | |
| Fe2+检测 | FerroOrange探针 | DOJINDO | F374 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime Institute of Biotechnology | P0013E |
| 核浆蛋白提取试剂盒 | Abbkine | KTP3001 | |
| qPCR | RNA提取试剂盒 | Fastagen | 220010 |
| cDNA合成超混物 | YEASEN | 11141ES | |
| ChamQ SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q341-02/03 | |
| 细胞活力检测 | CCK8试剂盒 | YEASEN | 40203ES |
| 线粒体膜电位检测 | JC-1荧光探针 | Beyotime Institute of Biotechnology | C2005 |
| RNA免疫沉淀 | RIP试剂盒 | Guangzhou Bersinbio Bioscience CO., LTD | Bes5101 |
| 抗体 | 抗4-HNE抗体 | Abcam | Ab48506 |
| 抗GPX4抗体 | ABclonal | A11243 | |
| 抗COX2抗体 | Proteintech | 66351-1-Ig | |
| 抗NRF2抗体 | Proteintech | 16396-1-AP |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | C57BL/6小鼠周龄、性别（雄性，6-8周）；GLP-1R敲除小鼠来源；建模方法（70%肝缺血，缺血时间60分钟，再灌注时间6小时）；麻醉药物（1%戊巴比妥钠）。 阅读提示：Methods 2.1 动物；2.4 肝缺血再灌注模型 |
| 药物处理 | 利拉鲁肽和GLP-1(9-37)的给药剂量（200 μg/kg皮下注射）；溶剂（生理盐水或DMSO稀释）；给药时间点（如图1A所示）；Fer-1（10 mg/kg腹腔注射）、ML385（30 mg/kg）、LDN193189（3 mg/kg）的给药方案。 阅读提示：Methods 2.3 试剂；图1A、图3A、图7G、图9L |
| 细胞模型 | Hep-G2细胞来源；培养基（MEM+10% FBS）；缺氧条件（1% O2, 5% CO2, 94% N2，H35低氧工作站）；缺氧48小时、复氧6小时；药物浓度（Lira和GLP-1(9-37)均为25 μmol/L）。 阅读提示：Methods 2.2 细胞；2.5 细胞缺氧复氧模型 |
| 铁死亡验证 | 高铁饮食（2%羰基铁饮食）喂养时间（14天）；检测指标（总铁含量、Fe2+、脂质过氧化、MDA、GSH、SOD、GPX4、COX2等）。 阅读提示：Methods 2.3 试剂；2.10 脂质过氧化物等检测；图3 |
| 机制验证 | Nrf2核转位检测（核浆分离）；GSK3β磷酸化位点（Ser9）；抑制剂使用（SN50、Leptomycin B、DIF-3）；SMAD159通路检测（Hepcidin、SMAD4核转位、下游基因）。 阅读提示：Methods 2.13 Western blot；图7、图9 |