检测USP7在KD患者和小鼠模型中的表达
验证USP7在KD中是否表达上调
通过RT-qPCR和免疫印迹检测KD患者白细胞、KD血清处理的HCAECs和KD小鼠心脏CD31+内皮细胞中USP7的表达；通过免疫组化和免疫荧光检测小鼠冠状动脉组织。
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USP7通过促进TGFβ2信号介导的内皮-间质转化和冠状动脉重塑加重川崎病
Involvement of USP7 in aggravating Kawasaki disease by promoting TGFβ2 signaling mediated endothelial-mesenchymal transition and coronary artery remodeling.
实验完整度
高包含体外细胞实验（HCAECs、293T）、体内小鼠模型（CAWS诱导KD模型）、scRNA-seq分析、USP7敲除和抑制剂干预，多重验证功能与机制。
主要模型
人冠状动脉内皮细胞（HCAECs） CAWS诱导的KD小鼠模型（C57BL/6J野生型和Usp7+/-小鼠） 293T细胞
重点核对
USP7在KD患者白细胞和HCAECs（KD血清处理）中的表达水平 TGF-β2（10 ng/mL）诱导HCAECs EndoMT的浓度和时间 CAWS（4 mg/只/天，连续5天）诱导KD小鼠模型的剂量和给药方式 P22077（10 mg/kg，腹腔注射，每周3次，持续4周）的治疗方案 SMAD2的K156和K383位点作为USP7去泛素化靶点
摘要
川崎病（KD）以系统性血管炎为特征，是儿科心脏病的主要原因。尽管近期研究强调了去泛素化酶在血管病理生理中的关键作用，但其对KD的具体贡献仍 largely unknown。在此，我们研究了去泛素化酶USP7在KD患者和CAWS诱导的KD小鼠模型中的作用。KD血清诱导的人冠状动脉内皮细胞（HCAECs）和KD小鼠心脏CD31+内皮细胞中USP7表达水平均升高。而敲除USP7可增加内皮细胞比例，并可能减轻KD小鼠心脏组织中升高的EndoMT、纤维化和炎症，与体外TGF-β2诱导的HCAECs实验结果一致。机制上，USP7与SMAD2/3相互作用，通过去除两者的K48泛素链并阻止其蛋白酶体降解来增强其蛋白稳定性，从而增加p-SMAD2水平和核内进入。重要的是，腹腔注射USP7抑制剂P22077在KD模型小鼠中产生了强大的抗EndoMT和抗血管炎症作用。因此，我们的研究揭示了增加的USP7通过增强TGFβ2/SMAD2/SMAD3信号传导，从而促进参与EndoMT、心脏纤维化和血管重塑的基因转录，在KD中的未被认识的功能。我们的发现提示USP7可能作为预防和治疗KD及相关血管疾病冠状动脉病变的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- USP7是否以及如何参与川崎病的发病过程，特别是在内皮-间质转化和冠状动脉重塑中的作用
- 核心机制
- USP7通过去除SMAD2和SMAD3的K48连接多聚泛素链，增强其蛋白稳定性，进而增加p-SMAD2水平及其核转位，促进TGFβ2信号介导的EndoMT相关基因转录。
- 主要证据
- 体外HCAECs和293T细胞实验证明USP7与SMAD2/3相互作用并去泛素化；体内Usp7+/-小鼠和P22077处理减轻CAWS诱导的EndoMT、纤维化和炎症；scRNA-seq显示USP7缺失增加内皮细胞比例，减少巨噬细胞和成纤维细胞。
- 研究意义
- USP7可作为预防和治疗川崎病冠状动脉病变及相关血管疾病的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外评估USP7对TGFβ2诱导EndoMT的影响
确定USP7是否调控TGFβ2介导的内皮-间质转化
在HCAECs中敲低USP7，用TGFβ2处理，检测EndoMT标志物（VE-cadherin, FN1, Vimentin等）、细胞迁移和通透性。
体内评估USP7缺失对KD小鼠心脏病理的影响
验证USP7在体内对KD相关病理的作用
对Usp7+/-和野生型小鼠注射CAWS，通过组织学染色（HE, EVG, Masson, Sirius Red）和免疫荧光评估炎症、纤维化和EndoMT。
单细胞转录组分析心脏细胞组成
探究USP7缺失对心脏细胞组成的影响
对WT-PBS, WT-CAWS, Usp7+/--PBS, Usp7+/--CAWS四组小鼠心脏进行scRNA-seq，分析细胞类型比例变化。
研究USP7调控SMAD2/3的分子机制
阐明USP7如何调控SMAD2/3蛋白稳定性
通过免疫共沉淀、体内去泛素化实验、CHX追踪实验和突变体分析，验证USP7与SMAD2/3的相互作用及其去泛素化作用。
评估USP7抑制剂P22077的治疗效果
测试药理学抑制USP7是否能减轻KD相关病理
在体外HCAECs和体内CAWS诱导的KD小鼠模型中，评估P22077对EndoMT、炎症和纤维化的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 内皮基础培养基-2 | Lonza | -- |
| EGM-2MV生长因子套装 | Lonza | CC-3202 | |
| DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Invitrogen | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Beyotime | -- | |
| 细胞转染 | jetPRIME转染试剂 | Polyplus | 101000046 |
| LongTrans转染试剂 | Ucallm | TF07 | |
| 细胞处理 | 重组人TGFβ2 | Proteintech | HZ-1092 |
| MG132蛋白酶体抑制剂 | Sigma | M7449 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RT-qPCR | 5×一键式RT预混液 | Abm | -- |
| 2x SYBR Green qPCR预混液 | Bimake | -- | |
| LightCycler®480实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013C |
| NP-40裂解液 | Sigma | -- | |
| 蛋白质定量 | Quick start Bradford蛋白定量试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | -- |
| 一抗稀释液 | Beyotime | P0023A | |
| SuperSignal West Femto超敏化学发光底物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 抗USP7抗体 | CST | 4833S | |
| 抗SMAD1抗体 | Cell Signaling | 6944T | |
| 抗SMAD2抗体 | Cell Signaling | 5339 | |
| 抗SMAD3抗体 | Cell Signaling | 9523S | |
| 抗SMAD4抗体 | Cell Signaling | 46535T | |
| 抗SMAD5抗体 | Cell Signaling | 9517T | |
| 抗SMAD2/3抗体 | Cell Signaling | 8685S | |
| 抗SMAD6抗体 | Abcam | ab273106 | |
| 抗磷酸化SMAD2抗体 | CST | 18338S | |
| 抗磷酸化SMAD3抗体 | CST | 9520S | |
| 抗Myc抗体 | Abbkine | A02060 | |
| 抗Flag抗体 | Sigma | F1804 | |
| 抗HA抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7392 | |
| 抗泛素抗体 | Santa Cruz | sc-8017 | |
| 抗β-actin抗体 | Proteintech | -- | |
| 抗Myc抗体 | Abmart | M20002L | |
| 抗SNAIL1抗体 | CST | 3879S | |
| 抗Vimentin抗体 | CST | 5741S | |
| 抗COL1A1抗体 | CST | 72026T | |
| 抗K48泛素抗体 | CST | 4289S | |
| 抗K63泛素抗体 | CST | 5621S | |
| 免疫沉淀 | 抗Myc磁珠 | MCE | HY-K0206 |
| 抗Flag磁珠 | Sigma-Merck | A2220 | |
| Western blot | 抗GAPDH抗体 | CST | 2188S |
| P22077抑制剂 | MCE | HY-13865 | |
| 免疫荧光 | 抗USP7抗体 | CST | 4833S |
| 抗CD31抗体 | Abcam | ab281583 | |
| 抗FN1抗体 | Abcam | ab268020 | |
| 抗磷酸化SMAD2抗体 | CST | 18338S | |
| 抗VE-cadherin抗体 | Thermo | 14-1449-82 | |
| Alexa Fluor 594标记山羊抗兔二抗 | CST | -- | |
| Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠二抗 | CST | -- | |
| ELISA | 人TGFβ2 ELISA试剂盒 | R&D Systems | DB250 |
| 人TNFα ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-H0109c | |
| 细胞分离 | CD31磁珠 | Miltenyi | 130-097-418 |
| 组织学染色 | 马松蓝溶液 | Beyotime | C0189S |
| 天狼星红染色试剂盒 | Solarbio | G1472 | |
| 单细胞测序 | 10×Genomics平台 | 10×Genomics | -- |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和处理 | HCAECs培养条件（EBM-2 + EGM-2MV Bullet Kit），TGF-β2处理浓度（10 ng/mL）和时间（36-72小时） 阅读提示：Methods 2.11 Cell culture and transfection |
| KD小鼠模型诱导 | CAWS制备方法，注射剂量（4 mg/只/天）和持续时间（连续5天），小鼠品系和年龄（4周龄雄性C57BL/6J） 阅读提示：Methods 2.2 Induction of a murine model of KD |
| USP7敲除小鼠 | Usp7+/-小鼠的基因敲除策略（CRISPR/Cas9），胚胎致死性说明 阅读提示：Methods 2.3 USP7 KO mice |
| P22077处理 | P22077剂量（10 mg/kg），给药方式（腹腔注射），频率（每周3次），持续时间（4周） 阅读提示：Methods 2.20 USP7 inhibitor treatment of the murine KD model induced by CAWS |
| 分子机制验证 | CHX浓度（50 μg/mL），MG132浓度（文中未明确说明），SMAD2突变体（K156R和K383R） 阅读提示：Methods 2.15 CHX chase assay, 2.16 Immunoprecipitation, 2.17 In vivo deubiquitination assay |