旋转培养装置构建肝类器官
验证旋转培养对HepaRG细胞形成肝类器官的影响
使用自研旋转平板腔（RFC），以10 rpm旋转培养HepaRG细胞与Matrigel混合物形成HGOs，静态培养作为对照，在1、3、5、7天观察形态和增殖。
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旋转培养通过YAP转位调控HepaRG来源肝类器官的形成
Rotating culture regulates the formation of HepaRG-derived liver organoids via YAP translocation.
实验完整度
高包含体外细胞实验、类器官培养、RNA-seq转录组分析、免疫荧光、Western blot、qPCR及YAP抑制剂功能验证，多层次验证机制。
主要模型
HepaRG细胞来源肝类器官（HGOs）
重点核对
旋转培养条件：RFC转速10 rpm，最大离心力小于1.5×10^-3 g 细胞接种密度：每穹顶4×10^3至5×10^3个细胞（总8×10^4至10×10^4个细胞） 培养时间：7天，在3天和7天进行功能检测 YAP抑制：0.1 μM Verteporfin (VP)处理最后24小时 对照组：静态培养
摘要
背景：肝类器官作为肝病理生理学中碳水化合物或脂质代谢以及外源物代谢转化的替代模型。包括太空飞行任务在内的生物力学线索可以影响肝类器官的构建及其相关功能，但其潜在机制尚未完全明了。在此，专门设计了一种旋转细胞培养装置，即旋转平板腔（RFC），用于贴壁细胞或细胞聚集体，以阐明改变的重力矢量对HepaRG来源肝类器官构建的影响。结果：在RFC下形成的类器官表现出快速的生长速率和较大的投影面积。同时，两个多能性标志物SOX9和CD44的表达增强。这一发现与YAP表达和核转位增加以及α4β6整合素表达升高呈正相关。抑制YAP表达和核转位降低了RFC下SOX9和CD44的表达，从而减弱了HepaRG来源肝类器官的多能性。结论：总之，我们提出了一种使用旋转培养的新型肝类器官构建方法，通过该方法构建的肝类器官的多能性由α4β6整合素和YAP转位介导。这项工作加深了重力矢量方向如何影响肝类器官构建及相关机械转导途径的理解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 旋转培养如何影响HepaRG来源肝类器官的形成，其潜在机械转导机制是什么？
- 核心机制
- 旋转培养通过α4β6整合素介导的机械转导促进YAP表达和核转位，上调干细胞标志物SOX9和CD44，从而维持肝类器官的多能性。
- 主要证据
- RNA-seq显示旋转培养7天后YAP1和整合素表达上调；免疫荧光和Western blot证实YAP核转位和α4β6整合素表达增加；VP抑制YAP后SOX9和CD44表达下降。
- 研究意义
- 提出一种基于旋转培养的新型肝类器官构建方法，加深了重力矢量方向影响肝类器官构建及机械转导途径的理解，为肝发育研究和肝类器官构建提供新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组分析
鉴定旋转培养下差异表达基因及相关通路
对旋转培养1、3、7天的HGOs进行RNA-seq，与静态对照比较，识别DEGs，并进行GO和KEGG富集分析。
干性标志物检测
验证旋转培养对HGOs干性维持的影响
通过免疫荧光、简单Western和qPCR检测SOX9和CD44在3天和7天的表达。
YAP和整合素表达及核转位分析
探究旋转培养对YAP和α4β6整合素表达及YAP核转位的影响
通过免疫荧光、Wes和qPCR检测YAP、p-YAP、ITGA6和ITGB4的表达，并分析YAP核/质比。
YAP功能抑制验证
验证YAP是否介导旋转培养对干性标志物的上调作用
使用YAP抑制剂Verteporfin处理HGOs，检测YAP核转位、下游靶基因CCND1和CYR61以及干性标志物SOX9和CD44的表达变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | William's E培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 0.25%胰蛋白酶溶液 | Gibco | -- | |
| 基质胶 | Corning | -- | |
| 细胞培养载玻片 | Nunc, Thermo-Fisher | -- | |
| 药物处理 | 维替泊芬 | MCE | -- |
| 活/死细胞染色 | Calcein/PI细胞活力/细胞毒性检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| Hoechst 33342 | -- | -- | |
| 共聚焦激光显微镜（LSM 880） | Zeiss | -- | |
| 细胞增殖检测 | E-Click EdU细胞增殖成像试剂盒 | Elabscience | -- |
| RNA提取 | RNAprep Pure Micro试剂盒 | Tiangen | -- |
| cDNA合成 | ReverTra Ace-a试剂盒 | Toyobo | -- |
| qPCR | GoTaq SYBR Green Master试剂 | Promega | -- |
| QuantStudio 7 | Thermo-Fisher | -- | |
| 引物 | Invitrogen | -- | |
| 免疫荧光染色 | SOX9抗体 | Abcam | ab185966 |
| CD44抗体 | Abcam | ab6124 | |
| YAP1抗体 | Abcam | ab195987 | |
| ITGA6抗体 | Abcam | ab20142 | |
| ITGB4抗体 | Abcam | ab133682 | |
| 兔IgG 647 | Abcam | ab150063 | |
| 小鼠IgG 594 | Abcam | ab150116 | |
| 豚鼠IgG 555 | Abcam | ab150186 | |
| Simple Western | 细胞回收液 | Corning | -- |
| RIPA裂解液 | -- | -- | |
| 蛋白酶抑制剂 | Cell Signaling Technol. | -- | |
| PhosSTOP™磷酸酶抑制剂 | Roche | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce®, Thermo Scientific | -- | |
| Wes™全自动蛋白表达分析系统 | ProteinSimple | -- | |
| SOX9抗体（Wes） | CST | 82630 | |
| CD44抗体（Wes） | CST | 3570 | |
| YAP1抗体（Wes） | CST | 14074 | |
| p-YAP抗体 | CST | 13008 | |
| ITGA6抗体（Wes） | CST | 3750 | |
| ITGB4抗体（Wes） | CST | 14803 | |
| GAPDH抗体 | CST | 2118 | |
| RNA测序 | TRIzol试剂 | Sigma-Aldrich | -- |
| Qubit® RNA检测试剂盒 | Thermo-Fisher | -- | |
| Qubit® 3.0荧光计 | Thermo-Fisher | -- | |
| Agilent Bioanalyzer 2100系统 | Agilent Technologies | -- | |
| Bio-RAD CFX 96荧光定量PCR仪 | Bio-RAD | -- | |
| Bio-RAD KIT iQ SYBR GRN试剂 | Bio-RAD | -- | |
| NovaSeq 6000 S4测序平台 | Illumina | -- | |
| NovaSeq 6000 S4试剂盒V1.5 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 旋转培养设备参数 | RFC转速：10 rpm；最大离心力：<1.5×10^-3 g；培养室尺寸：66 mm × 19 mm × 3 mm；培养基体积：约3.8 mL 阅读提示：Methods: Liver organoids formation in rotating flat chamber device |
| 细胞接种与培养 | HepaRG细胞来源；接种密度：每穹顶4×10^3-5×10^3个细胞；Matrigel用量：400 μL；培养基更换频率：每2天 阅读提示：Methods: HepaRG cell culture; Liver organoids formation in rotating flat chamber device |
| YAP抑制处理 | VP浓度：0.1 μM；处理时间：最后24小时 阅读提示：Methods: HepaRG cell culture |
| 形态学分析 | 使用ImageJ计算最大投影面积、圆度、长宽比；样本量n≥30 阅读提示：Results: Rotating culture promotes the formation...; Figure legends Fig. 1 |
| qPCR检测 | 内参基因：GAPDH；生物学重复：≥3；引物序列见表1 阅读提示：Methods: Quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR) test |
| 蛋白表达检测 | Wes系统；抗体稀释度见表3；蛋白上样量：每孔3 μL；归一化：GAPDH 阅读提示：Methods: Simple western assay |
| 免疫荧光分析 | 一抗稀释度见表2；二抗稀释度；MFI定量：外周vs内部 阅读提示：Methods: Immunofluorescence staining and confocal microscopy |
| RNA-seq分析 | DEGs筛选标准：p≤0.05且foldchange≥1.5；比对参考基因组；数据提交号PRJNA1080078 阅读提示：Methods: RNA sequencing and analysis |