细胞活力测定
评估FFAR2和FFAR4激动剂对结直肠癌细胞和非癌结肠细胞活力的影响。
使用MTT法检测不同浓度（10–200 µM）的4-CMTB和GSK137647处理48小时后CCD 841 CoN和SW-480细胞的活力。
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合成游离脂肪酸受体（FFAR）2激动剂4-CMTB和FFAR4激动剂GSK13764抑制结肠癌细胞生长和迁移并调节结直肠癌体外和体内模型中FFARs的表达
Synthetic free fatty acid receptor (FFAR) 2 agonist 4-CMTB and FFAR4 agonist GSK13764 inhibit colon cancer cell growth and migration and regulate FFARs expression in in vitro and in vivo models of colorectal cancer.
实验完整度
中包含体外细胞活力、迁移侵袭实验、qPCR和Western blot，以及AOM/DSS小鼠模型，但体内实验未观察到抗肿瘤效果。
主要模型
人正常结肠上皮细胞系CCD 841 CoN 人结直肠腺癌细胞系SW-480 AOM/DSS诱导的结肠炎相关结直肠癌小鼠模型
重点核对
细胞活力实验：4-CMTB和GSK137647浓度范围10–200 µM，处理48小时 迁移和侵袭实验：4-CMTB浓度25 µM，GSK137647浓度50 µM 体内实验：4-CMTB剂量10 mg/kg，GSK137647剂量1 mg/kg，腹腔注射，每3天一次 qPCR和Western blot：用于评估FFAR2和FFAR4表达变化
摘要
引言：游离脂肪酸受体（FFARs）是G蛋白偶联受体，分为4种亚型；FFAR2和FFAR3由短链脂肪酸激活，而FFAR1和FFAR4由长链脂肪酸激活。近期研究表明FFARs可能参与结直肠癌（CRC）的病理生理过程。在CRC患者中观察到FFAR2和FFAR4基因表达降低。我们研究的目的是评估在CRC的体外和体内模型中，选择性合成激动剂刺激FFAR2和FFAR4的抗癌效果。材料与方法：使用FFAR2激动剂4-CMTB和FFAR4激动剂GSK137647。使用MTT法测定与测试化合物孵育48小时后的细胞活力（CCD 841 CoN和SW-480）。使用实时qPCR和Western Blot来鉴定FFARs表达的变化。迁移和侵袭通过市售试剂盒表征。通过氧化偶氮甲烷和葡聚糖硫酸钠诱导结肠炎相关的结直肠癌（CACRC）小鼠模型。结果：4-CMTB和GSK137647显著降低了癌细胞生长以及迁移和侵袭能力。两种合成化合物均增加了SW-480细胞中FFAR2和FFAR4的表达。4-CMTB和GSK137647均不影响AOM/DSS诱导的CACRC小鼠的病程，然而，4-CMTB升高了小鼠组织中的FFAR2蛋白表达。结论：我们提出FFAR2和FFAR4的刺激可能抑制CRC细胞活力和迁移，并且CRC中降低的FFAR2和FFAR4表达可以通过用相应的激动剂处理而恢复，表明CRC治疗中新的有前景的药理学靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FFAR2和FFAR4的激活是否在体内外结直肠癌模型中具有抗癌作用，并影响FFARs表达？
- 核心机制
- FFAR2和FFAR4激动剂通过升高癌细胞中FFAR2和FFAR4基因表达来抑制细胞生长、迁移和侵袭。
- 主要证据
- 体外实验中，4-CMTB和GSK137647显著降低SW-480细胞活力和迁移侵袭能力，并增加FFAR2和FFAR4基因表达；体内实验中，4-CMTB升高小鼠结肠组织Ffar2蛋白水平。
- 研究意义
- FFAR2和FFAR4可能是CRC治疗的新药理学靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
基因表达分析
检测FFAR2和FFAR4激动剂处理对FFAR2和FFAR4基因表达的影响。
使用实时qPCR检测FFAR2和FFAR4基因在CCD 841 CoN和SW-480细胞中的表达，以HPRT1作为内参基因。
蛋白表达分析
评估FFAR2和FFAR4激动剂处理对FFAR2和FFAR4蛋白水平的影响。
通过Western blot检测细胞裂解物和结肠组织中FFAR2和FFAR4蛋白表达。
迁移和侵袭实验
评估FFAR2和FFAR4激动剂对结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响。
使用划痕愈合实验和Matrigel侵袭实验测定SW-480细胞的迁移和侵袭。
体内AOM/DSS模型
评估FFAR2和FFAR4激动剂对AOM/DSS诱导的结肠炎相关结直肠癌小鼠模型的抗癌作用。
建立AOM/DSS诱导的CACRC小鼠模型，给予4-CMTB或GSK137647治疗，评估肿瘤数量、器官重量、结肠长度等指标。
组织学分析
评估AOM/DSS小鼠结肠的组织病理学变化。
结肠组织进行苏木精-伊红染色，评估炎症、形态、溃疡和淋巴滤泡评分。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
细胞活力检测
基因表达检测
蛋白表达检测
细胞迁移和侵袭检测
动物模型建立
组织学分析
统计分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | EMEM培养基 | Gibco® | -- |
| RPMI培养基 | Gibco® | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 药物处理 | 4-CMTB | Tocris Bioscience | 4642 |
| GSK137647 | Tocris Bioscience | 5257 | |
| 细胞活力检测 | MTT | -- | -- |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| iMARK酶标仪 | Biorad | -- | |
| 侵袭实验 | BioCoat Matrigel侵袭小室 | Becton Dickinson | 354480 |
| 结晶紫 | -- | -- | |
| EVOS FLoid细胞成像系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 迁移实验 | Falcon®通透性支持物 | Corning | 353097 |
| RNA提取 | TRIzol®试剂 | Invitrogen™ | -- |
| Calibri微量分光光度计 | Biocompare | -- | |
| 逆转录 | 高容量逆转录试剂盒 | Life Technologies | -- |
| qPCR | TaqMan基因表达预混液 | Life Technologies | -- |
| LightCycler 96仪器 | Roche | -- | |
| 蛋白提取 | 哺乳动物细胞裂解缓冲液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | -- | -- | |
| Precellys Evolution匀浆器 | Bertin Instruments | -- | |
| 蛋白定量 | Pierce 660 nm蛋白质测定 | Thermo Scientific | -- |
| 二辛可宁酸蛋白测定试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Western blot | SDS-PAGE凝胶 | Bio-Rad | -- |
| PVDF膜 | Life Technologies | -- | |
| 脱脂奶粉 | -- | -- | |
| 吐温20 | -- | -- | |
| FFAR2多克隆抗体 | FabGennix, Thermo Fisher | FFAR2-201AP | |
| FFAR4多克隆抗体 | Elabscience | E-AB-92023 | |
| TGF-β多克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 3711 | |
| EGFR多克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 2232 | |
| pEGFR多克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 2234 | |
| HRP抗β-actin抗体 | Abcam | ab49900 | |
| 抗兔抗体 | Sigma-Aldrich | A9169 | |
| 抗小鼠抗体 | Merck | AP200P | |
| Super Signal West Pico蛋白质印迹底物 | Thermo Scientific | -- | |
| ImageLab v5.2.1 | Bio-Rad | -- | |
| 动物实验 | 氧化偶氮甲烷 | Sigma-Aldrich | A5486 |
| 葡聚糖硫酸钠 | PanReac AppliChem | A3261 | |
| 组织学 | 福尔马林 | -- | -- |
| Axio Imager A2显微镜 | Carl Zeiss | -- | |
| ZEN (Blue 2.5 edition)成像软件 | Carl Zeiss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞活力实验 | 细胞系、细胞密度、化合物浓度、处理时间、MTT孵育时间 阅读提示：Materials and methods - Cytotoxicity Assessment 和 Figure 1 legend |
| 迁移和侵袭实验 | 细胞系、化合物浓度、处理时间、基质胶类型 阅读提示：Materials and methods - Invasion Assay 和 Migration Assay |
| 基因表达分析 | 细胞系、处理浓度、处理时间、内参基因 阅读提示：Materials and methods - Quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) |
| 蛋白表达分析 | 细胞或组织样本、抗体信息 阅读提示：Materials and methods - Protein isolation and western blot |
| 体内实验 | 小鼠品系、AOM剂量、DSS浓度、给药方案、组别设置 阅读提示：Materials and methods - Azoxymethane/Dextran sulfate Sodium-Induced Colitis-Associated Colorectal Cancer Model |
| 组织学分析 | 切片厚度、染色方法、评分标准 阅读提示：Materials and methods - Histology |