构建CPVA犬模型及电生理检测
建立环肺静脉消融后长期模型并评估心电生理改变
将10只比格犬随机分为CPVA组和假手术组，术后观察6个月，进行电生理检查检测AERP和房颤诱导性。
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环肺静脉消融后犬心肌的多组学分析：神经肽Y对房颤长期再诱导的影响
Multiomics analysis of canine myocardium after circumferential pulmonary vein ablation: Effect of neuropeptide Y on long-term reinduction of atrial fibrillation.
实验完整度
中包含犬CPVA模型、电生理检测、转录组与蛋白质组、组织学验证及体外细胞实验，但缺乏体内干预实验，主要机制验证仅限于体外。
主要模型
比格犬环肺静脉消融模型 原代大鼠心房肌细胞 原代大鼠心脏成纤维细胞
重点核对
CPVA组犬心房AERP在6个月时从117ms缩短至92ms CPVA组纤维化相关蛋白Fibronectin1、Collagen III、FAP、Vimentin、α-SMA表达升高及Masson和天狼星红染色胶原面积增加 NPY浓度梯度处理原代心房肌细胞，CCK-8确定150nM最佳，流式检测凋亡及Western blot检测Bcl2/Bax
摘要
导管消融（CA）是心房颤动（AF）介入治疗的重要方法，降低CA术后远期复发非常重要。CA术后复发的机制仍不清楚。我们建立了比格犬环肺静脉消融（CPVA）后的长期模型。分别利用高通量测序和TMT标记的LC-MS/LC分析获得转录组和蛋白质组。筛选差异表达基因和蛋白质并进行富集分析，发现纤维化的影响并在组织中验证。选择下调蛋白神经肽Y（NPY）进行验证，结果表明NPY可能在CPVA术后AF长期再诱导中发挥作用。随后，进一步研究了NPY的分子机制。结果显示，CPVA术后心房有效不应期（AERP）缩短，纤维化增加。NPY干预可减轻心房肌细胞凋亡，并抑制心脏成纤维细胞中Akt的激活。这些结果表明，CPVA术后NPY的长期抑制可能通过促进心肌细胞凋亡和激活心脏成纤维细胞中的Akt通路导致AF的诱导，这可能使AF更易再诱导。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探讨环肺静脉消融后房颤长期再诱导的机制，特别是神经肽Y在其中的作用。
- 核心机制
- CPVA术后NPY长期下调可能通过促进心肌细胞凋亡和激活心脏成纤维细胞中的PI3K-Akt通路，导致心房纤维化，从而增加房颤再诱导风险。
- 主要证据
- 犬模型电生理检测AERP缩短，组织学显示纤维化增加；体外实验表明NPY浓度依赖性减轻原代心房肌细胞凋亡并抑制成纤维细胞Akt激活及纤维化蛋白表达。
- 研究意义
- 为房颤消融后复发机制的潜在干预靶点提供新的见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组和蛋白质组分析
筛选CPVA后差异表达基因和蛋白及富集通路
提取靶心房组织RNA进行RNA-seq，蛋白质进行TMT标记LC-MS/MS，鉴定DEGs和DEPs，并进行GO和KEGG富集分析。
验证纤维化和NPY表达
验证CPVA后心房组织纤维化程度及NPY变化
Western blot和qRT-PCR检测NPY表达，Western blot检测纤维化相关蛋白，Masson和天狼星红染色评估纤维化程度。
体外验证NPY对心肌细胞凋亡和成纤维细胞纤维化的作用
探究NPY对原代心房肌细胞凋亡和成纤维细胞活化的影响
分离原代大鼠心房肌细胞和成纤维细胞，用不同浓度NPY处理，通过CCK-8、流式细胞术、Western blot和免疫荧光检测凋亡和纤维化指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Magen | R4801-02 |
| RNA质量检测 | Nanodrop分光光度计 | ThermoFisher | ND-2000 |
| RNA完整性检测 | Agilent 4150生物分析仪 | Agilent Technologies Inc. | -- |
| 蛋白组学 | 高pH反相肽分馏试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| Empore SPE C18小柱 | Sigma | -- | |
| 心肌细胞分离 | 无EDTA胰蛋白酶 | Solarbio | -- |
| 心肌细胞培养 | 溴脱氧尿苷 | Sigma | -- |
| 细胞增殖检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Elabscience | -- |
| 药物处理 | 神经肽Y | MCE | HY-P0198A |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Yeasen Biotechnology | -- |
| 免疫荧光 | DAPI染色液 | Beyotime Biotechnology | -- |
| 抗淬灭剂 | Servicebio | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime Biotechnology | -- |
| 磷酸酶抑制剂 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG | Beyotime Biotechnology | -- | |
| β-肌动蛋白抗体 | CST | 3700 | |
| NPY抗体 | CST | 11976 | |
| 纤连蛋白1抗体 | Abcam | ab268020 | |
| III型胶原抗体 | Proteintech | 22734-1-AP | |
| 成纤维细胞活化蛋白抗体 | Abcam | ab314456 | |
| 波形蛋白抗体 | Abcam | ab92547 | |
| α-平滑肌肌动蛋白抗体 | Proteintech | 55135-1-AP | |
| Bcl2抗体 | Proteintech | 26593-1-AP | |
| Bax抗体 | CST | 2772 | |
| I型胶原抗体 | Abcam | ab260043 | |
| 转化生长因子β1抗体 | Abcam | ab215715 | |
| 磷酸化Akt Ser473抗体 | CST | 4060 | |
| Akt抗体 | CST | 4691 | |
| qRT-PCR | 逆转录试剂盒 | Invitrogen | -- |
| 实时定量PCR试剂盒 | Invitrogen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CPVA模型构建 | 犬种、体重、分组（CPVA组和对照组各5只）、手术方式（右第四肋间开胸）、消融导管（7Fr，4mm尖端）、消融终点（左PV根部连续消融线）、术后观察时间（6个月） 阅读提示：Methods 2.2节及图1A、B |
| 电生理检测 | AERP测定方法（S1-S2程序刺激，基础周期350ms，S2耦联间期200ms，步长5ms）、AF诱导定义（快速不规则心房律持续>10s）、电极位置（左心房游离壁、高位左房、左心耳） 阅读提示：Methods 2.3节及图1C、E、F、G |
| 转录组和蛋白质组分析 | RNA提取方法（TRIzol）、建库方法（mRNA富集、片段化、cDNA合成、末端修复、PCR富集）、测序平台、差异表达阈值（DEGs：|log2FC|≥1，校正p<0.05；DEPs：|log2FC|≥0.26，p<0.05） 阅读提示：Methods 2.4-2.7节，补充材料Table S1、S2 |
| 原代细胞实验 | SD大鼠年龄（1-3天）、组织消化方法（0.08%无EDTA胰蛋白酶、0.08%胶原酶II）、NPY浓度（0、1、10、50、100、150、200、250、300 nM）、处理时间（48h）、CCK-8检测波长（450nm）、凋亡检测（Annexin V-FITC/PI）、Western blot检测靶蛋白 阅读提示：Methods 2.9-2.13节，图4 |